Campylobacter är den främsta orsaken till bakteriell livsmedelsburen gastroenterit över hela världen. Trots att anläggningar vidtar åtgärder för att minska förekomsten i sina anläggningar når kontaminerade produkter konsekvent konsumenterna. Tekniken som utvecklats under de senaste tolv åren tar itu med begränsningar i befintliga metoder för att isolera och detektera Campylobacter spp. från rått kött.
Denna artikel presenterar ett snabbt men robust protokoll för att isolera Campylobacter spp. från rått kött, med särskilt fokus på Campylobacter jejuni och Campylobacter coli. Protokollet bygger på etablerade metoder och säkerställer kompatibilitet med de rådande tekniker som används av tillsynsorgan som Food and Drug Administration (FDA) och US Department of Agriculture (USDA) i USA, samt International Organization for Standardization (ISO) i Europa. Centralt i detta protokoll är att samla upp ett sköljmedel, som koncentreras och återsuspenderas i Bolton Broth-media som innehåller hästblod. Detta medium har visat sig underlätta återhämtningen av stressade Campylobacter-celler och minska den nödvändiga anrikningstiden med 50 %. De anrikade proverna överförs sedan till nitrocellulosamembran på brucellaplattor. För att förbättra metodens sensitivitet och specificitet utvärderades filtermembran med porstorlek på 0,45 μm och 0,65 μm. Data visade en 29-faldig ökning av cellåterhämtningen med filtret med 0,65 μm porstorlek jämfört med 0,45 μm porstorlek utan att påverka specificiteten. De mycket rörliga egenskaperna hos Campylobacter gör det möjligt för cellerna att aktivt röra sig genom membranfiltren mot agarmediet, vilket möjliggör effektiv isolering av rena Campylobacter-kolonier . Protokollet innehåller multiplex kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (mqPCR) analys för att identifiera isolaten på artnivå. Denna molekylära teknik erbjuder ett tillförlitligt och effektivt sätt att identifiera arter. Undersökningar som genomförts under de senaste tolv åren med kött i detaljhandeln har visat att denna metod kan förbättra återvinningen av Campylobacter från naturligt kontaminerade köttprover jämfört med nuvarande referensmetoder. Dessutom har detta protokoll minskad förberedelse- och bearbetningstid. Som ett resultat presenterar det ett lovande alternativ för effektiv återhämtning av Campylobacter från kött. Dessutom kan denna procedur integreras sömlöst med DNA-baserade metoder, vilket underlättar snabb screening av positiva prover tillsammans med omfattande helgenomsekvenseringsanalys.
Campylobacter spp. är den främsta orsaken till bakteriell livsmedelsburen gastroenterit i världen, med uppskattningsvis 800 miljoner fall årligen1. Som en stor zoonotisk bakterie koloniserar Campylobacter naturligt mag-tarmkanalerna hos ett brett spektrum av djur, inklusive vilda fåglar, husdjur och husdjur. Vid slakt eller livsmedelsbearbetning kontaminerar Campylobacter spp. ofta slaktkroppar eller köttprodukter3. Campylobacterios är vanligtvis förknippad med konsumtion av dåligt tillagat fjäderfä eller korskontaminering av andra livsmedel med rå fjäderfäjuice2. Det kan orsaka allvarliga komplikationer, såsom Guillain-Barrés syndrom, reaktiv artrit och blodförgiftning hos personer med nedsatt immunförsvar4. Att upptäcka och isolera Campylobacter från livsmedelskällor, särskilt fjäderfäprodukter, är avgörande för folkhälsoövervakning, utredning av utbrott och riskbedömning.
Konventionella odlingsbaserade metoder är de traditionella och standardmetoderna för detektion av Campylobacter 5,6. Det finns dock flera begränsningar, inklusive långa inkubationstider (48 timmar eller mer), låg känslighet (upp till 50 %) och är inte inkluderande för alla stammar (vissa stressade Campylobacter-celler kanske inte växer bra eller inte alls i media)7. Molekylära metoder, såsom polymeraskedjereaktion (PCR), är snabbare och känsligare än odlingsbaserade metoder, men de ger inte livskraftiga isolat för vidare karakterisering 8,9.
Immunologiska metoder är alternativa och kompletterande metoder för detektion av Campylobacter . Dessa är snabba, enkla och mångsidiga, men har också flera begränsningar, inklusive korsreaktivitet (vissa antikroppar kan binda till icke-Campylobacter-bakterier eller andra ämnen som delar liknande antigener), låg specificitet (vissa antikroppar kanske inte binder till alla Campylobacter-stammar eller serotyper) och provberedningskrav (immunologiska metoder kräver ofta förbehandling av proverna för att avlägsna störande ämnen för att förbättra bindningen av antikropparna)10. – Herr talman,
Inom släktet Campylobacter orsakar C. jejuni och C. coli de flesta Campylobacterinfektioner hos människa (81 % respektive 8,4 %)11. Båda är spiralformade, mikroaerofila och termofila bakterier som innehåller en unipolär flagell eller bipolär flagell. Rotation av en flagell vid varje pol anses vara både den primära drivkraften för dess karakteristiska korkskruvsrörlighet och avgörande för dess patogenes eftersom det gör det möjligt för bakterien att simma genom den trögflytande slemhinnan i värdens mag-tarmkanal. Motiliteten hos Campylobacter styrs av dess kemosensoriska system som gör att cellerna kan röra sig mot gynnsamma miljöer12,13. Baserat på cellmorfologin och fysiologiska egenskaperna hos Campylobacter har några studier använt membranfiltrering för isolering av Campylobacter spp. från fekala och miljömässiga prover 14,15,16.
Denna studie presenterar ett snabbt och robust protokoll för isolering och efterföljande detektion av C. jejuni och C. coli från rått kött, vilket övervinner nackdelarna med de befintliga metoderna och erbjuder flera fördelar. Tentativa kolonier kan bekräftas som Campylobacter spp. med hjälp av en mängd olika metoder, såsom mikroskopi, biokemiska tester (t.ex. katalas- och oxidasaktivitetsanalyser) eller molekylära metoder6. Metoden identifierar isolaten på artnivå med hjälp av en multiplex realtids-PCR-analys (mqPCR) som riktar sig mot gener som är unika för C. jejuni och C. coli. Denna metod är relativt billig, snabb och selektiv, vilket gör den lämplig för användning i en mängd olika miljöer, inklusive livsmedelsbearbetningsanläggningar, kliniska laboratorier och forskningslaboratorier.
Protokollets betydelse
C. jejuni och C. coli var de två viktigaste arterna av Campylobacter som var vanliga hos fjäderfä22 och djurlever23,24. I denna studie samlades köttprover från kycklingdelar (ben, vingar och lår), kycklinglever och nötlever slumpmässigt in under olika tidsperioder och från olika butiker och tillverkare för isolering av Campylobacter spp. Av de totalt 49 isolerade Campylobacter-stammarna identifierades 36 som C. jejuni och 13 som C. coli, utan att några andra Campylobacter-arter hittades, vilket överensstämmer med andra rapporter25.
Analysen är baserad på den spiralformade cellmorfologin och den karakteristiska korkskruvsliknande motiliteten hos Campylobacter spp. En enkel, men effektiv, passiv filtreringsteknik26,27 som utnyttjade dess spiralformade cellmorfologi (lång, smal, 0,2-0,9 x 0,5-5 μm) och starka korkskruvsrörlighet användes för att separera Campylobacter från en blandning av bakgrundsorganismer. Den höga rörligheten hos Campylobacter gjorde det möjligt för cellerna att passera membranfiltren och röra sig mot gynnsamma förhållanden som finns i agarmediet, medan andra bakgrundsmikroorganismer från köttprodukterna inte kunde passera igenom. Denna metod är relativt billig, snabb och selektiv, vilket gör den lämplig för användning i en mängd olika miljöer, inklusive livsmedelsbearbetningsanläggningar, kliniska laboratorier och forskningslaboratorier.
En banbrytande artikel som ofta citeras säger att 0,45 μm-filtret fungerade så bra att 0,65 μm inte utvärderades28. Resultaten från den aktuella studien indikerar att filtret med en porstorlek på 0,65 μm presterade betydligt bättre än ett porstorlek på 0,45 μm, vilket resulterade i en 29-faldig ökning av antalet celler som återhämtades från anrikningen. Detta är viktigt eftersom de valda filtren inte visar minskad selektivitet som tidigare rapporterats29. Vidare, eftersom det är känt att filtrering avsevärt minskar mängden Campylobacter som återvinns jämfört med direkt plätering30, förbättrar därför en ökning av porstorleken återhämtningen av mikroorganismen, vilket överensstämmer med tidigare rapporterade fynd21. Detta är viktigt eftersom alla celler som passerade filtren bildade enhetliga Campylobacter-kolonier , vilket tyder på att båda filtren var tillräckliga för att hindra annan mikroflora och matpartiklar från att passera igenom. Dessutom noterar FSIS-flödesschema7 potentialen för förlängd resultatproduktion på grund av återstrimmiga isolat på Campy-Cefex-plattor som innehåller antibiotika. Däremot har det protokoll som beskrivs i detta manuskript, som kombinerar användningen av filtrering och selektiv anrikning med cefoperazon, cykloheximid, trimetoprim och vankomycin, inte krävt omstrykning.
Den nuvarande metoden som används överensstämmer med FSIS nuvarande provtagnings- och kontrollprogram17. Eftersom nivån av Campylobacter-kontamination kan vara låg (153 CFU/450 g kyckling) centrifugeras sköljningen så att provet koncentreras med en faktor fyra, vilket ökar analysens känslighet. Efter att ha koncentrerat sköljet med en faktor 4 x anrikas proverna i 48 timmar och screenas med Molecular Detection System (MDS) för att replikera den metod som används av FSIS-laboratorier (data visas inte). Noterbart är att den beskrivna metoden ännu inte har misslyckats med att identifiera positiva stammar inom 24 timmar som detekterades av det molekylära detektionssystemet med 48 timmars anrikning (data visas inte). Slutligen är en ytterligare fördel med detta protokoll att det kan ge information relaterad till bakteriearten och identifiera om Campylobacter är C. coli, C. jejuni eller C. lari, medan MDS som används i MLG 41.07 endast kan ge ett binärt positivt/negativt svar för Campylobacter.
Kritiska steg
Protokollet för isolering och identifiering av Campylobacter kräver precision under centrifugering, filtrering och molekylär analys. Noggranna utspädningar, korrekta inkubationsförhållanden och noggrann efterlevnad av qPCR-analysförhållanden är avgörande för tillförlitlig artidentifiering.
Som en mikroaerofil bakterie är Campylobacter mycket ömtålig och känslig för olika miljöpåfrestningar och kräver unika krångliga förhållanden för tillväxt 31,32,33. I livsmedelsprover som vanligtvis genomgår långa perioder av transport och lagring är många Campylobacter-celler kanske i en dvala eller subletalt/dödligt skadat tillstånd34,35. Därför är det viktigt att återvinna de stressade cellerna från deras matmatriser och odla dem till en högre koncentration. I det första steget av proceduren använde vi Bolton buljong kompletterad med lakat hästblod och antibiotika för selektiv berikning av Campylobacter från mat. Tilläggsblodet fungerade som ett syresläckningsmedel för att övervinna de negativa effekterna av fria syreradikaler36. Antibiotikan användes för att hämma tillväxten av bakgrundsmikrofloran37.
För att minimera exponeringstiden för Campylobacter för omgivande atmosfäriskt syre valdes en inkubationstid på 15 minuter för att tillåta cellerna att passera filtret. Fukten i Brucella-agarplattan under filtret spelade också en viktig roll för passagehastigheten. Specifikt tydde resultaten från testning av agarplattor som torkats i 0 h, 1 h, 2 h och 3 h på att en hög fukthalt i filtret hindrade celler från att passera igenom. Lika viktigt är den exakta placeringen av filter och droppar på plattorna och filtren, som båda påverkar framgången med att isolera celler.
Potentiella fallgropar och begränsningar
Samtidigt som man presenterar ett strukturerat tillvägagångssätt för att isolera och identifiera Campylobacter-arter från råa kycklingprover, förtjänar flera begränsningar i detta protokoll att uppmärksammas. Extern kontaminering, otillräckligt torkade plattor, igensättning av filter som hindrar mikrobiell rörelse, instängning av mikroorganismerna i pelleten, ofullständig tätning av den atmosfäriska kammaren och droppar som sprider sig utanför filtergränserna är bland de främsta fallgroparna.
Otillräcklig separation av mikroorganismerna från livsmedlens ytor eller deras inneslutning i huvuddelen av provet kan hindra isoleringen av dem med denna metod. Att förlita sig på mikrobiell rörlighet för passage genom passiva filter utgör dessutom en anmärkningsvärd begränsning; Det är möjligt att filtermembranen behöll några mindre rörliga Campylobacter-stammar , eftersom det har visats att filter kan minska infångningseffektiviteten hos mikrobiella patogener i livsmedel38. Ytterligare begränsningar omfattar centrifugerings- och filtreringsprocessernas satsvisa karaktär, känslighet för igensättning av filter och ineffektivitet vid spridning av den bildade pelleten, vilket kommer att påverka noggrannheten hos mikrobiella belastningar. Dessa begränsningar betonar sammantaget behovet av försiktighet och kompletterande metoder för att säkerställa omfattande analys, särskilt när man hanterar olika provtyper eller söker kapacitet med hög genomströmning.
Förslag på felsökning
För att förebygga potentiella problem, se först till att allt material följer de nödvändiga kvalitetsstandarderna och inte har gått ut. Felsök igensatta filter genom att eventuellt använda en extra filtrering för att avlägsna alla stora föroreningar som kan begränsa passagen av Campylobacter genom nitrocellulosamembranet. Om kontaminering observeras, kontrollera att dropparna inte placerades för nära filtrets kant och tillät vätska att nå agarn genom att gå runt filtret i motsats till genom porerna. Om det inte finns tillräcklig tillväxt efter anrikning, kontrollera att tätningarna på de atmosfäriska behållarna är täta och inte läcker.
Potentiell förfining och expansion
Att utforska alternativa filtermaterial kan förbättra mikrobiell passage och göra det möjligt att utöka detta protokoll för användning för att isolera andra rörliga mikroorganismer från heterogena blandningar som livsmedel. Det rekommenderas att identifiera kontroller för att behålla mindre rörliga Campylobacter-varianter utan att påverka specificiteten negativt. Dessutom, medan den multiplexerade qPCR-analysen som användes i denna studie visade sig ha förmågan att detektera C.lari18 , kan andra Campylobacter-arter av intresse inkluderas i denna analys.
Sammanfattningsvis, genom att utvärdera olika parametrar och inställningar, fastställdes lämpliga förhållanden för filterbaserad isolering och artnivåidentifiering av C. jejuni och C. coli från livsmedel. Metoden har visat sig vara känslig, specifik, robust och kostnadseffektiv. Genom att tillämpa det på riktiga livsmedelsprover kunde protokollet isolera 36 C. jejuni – och 13 C. coli-stammar från 79 köttförpackningar.
Protokollet är anpassat till FSIS-direktivet 10,250.117, som beskriver förfarandet för provtagning av råa kycklingdelar, och MLG 41.076 för isolering och identifiering av Campylobacter. Data tyder på att koncentration av provet med 4x och anrikning i 24 timmar, i kombination med filtrering och plätering, ger isolerade, bekräftade kolonier inom 48 timmar i motsats till 96 timmar. Protokollet är kompatibelt med DNA-baserade metoder som genomsekvensering för att ge en omfattande karakterisering av Campylobacter-stammar , inklusive deras antimikrobiella resistensprofiler, virulensförutsägelser och fylogenetiska relationer. Protokollet utgör ett lovande alternativ för effektiv återhämtning och isolering av Campylobacter spp. från rått fjäderfä, vilket kan underlätta epidemiologiska studier och folkhälsoinsatser.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), National Program 108, Current Research Information System-nummer 8072-42000-093 och 8072-42000-094-000-D. Omnämnande av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna artikel är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande av U.S. Department of Agriculture. USDA är en leverantör av lika möjligheter och arbetsgivare.
Agar – Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
Autoclave – Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
DNA Extraction – PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
Filter – 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
Filter – 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
Incubator – Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
Inoculating Loop – Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
Mixer – Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
Realtime PCR – 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
Spreader – Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
Water Filtration – Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |