Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.
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Articolo metodologico
Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La terapia genica è una potente tecnologia per fornire nuovi geni a un paziente per il trattamento della malattia, sia per introdurre un gene funzionale, inattivare un gene tossico o fornire un gene il cui prodotto può modulare la biologia della malattia. Il metodo di somministrazione del vettore terapeutico può assumere molte forme, che vanno dall'infusione endovenosa per la somministrazione sistemica all'iniezione diretta nel tessuto bersaglio. Per le malattie neurodegenerative, è spesso auspicabile inclinare la trasduzione verso il cervello e/o il midollo spinale. L'approccio meno invasivo per colpire l'intero sistema nervoso centrale prevede l'iniezione nel liquido cerebrospinale (CSF), consentendo alla terapia di raggiungere un'ampia frazione del sistema nervoso centrale. L'approccio più sicuro per rilasciare un vettore nel liquido cerebrospinale è l'iniezione intratecale lombare, in cui un ago viene introdotto nella cisterna lombare del midollo spinale. Questa tecnica, nota anche come puntura lombare, è stata ampiamente utilizzata nei roditori neonatali e adulti e nei modelli animali di grandi dimensioni. Sebbene la tecnica sia simile tra le specie e gli stadi di sviluppo, sottili differenze nelle dimensioni, nella struttura e nell'elasticità dei tessuti che circondano lo spazio intratecale richiedono sistemazioni nell'approccio. Questo articolo descrive un metodo per eseguire la puntura lombare nei ratti giovani per fornire un vettore del sierotipo 9 adeno-associato. Qui, 25-35 μL di vettore sono stati iniettati nella cisterna lombare e un reporter di proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato per valutare il profilo di trasduzione risultante da ciascuna iniezione. Vengono discussi i vantaggi e le sfide di questo approccio.
Introduzione
La promessa delle terapie geniche mediate da virus è stata finalmente realizzata negli ultimi anni con l'approvazione da parte della FDA di trattamenti per l'atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica, l'emofilia del fattore IX, il cancro e altro ancora. Innumerevoli altre terapie sono attualmente in fase di sviluppo. La terapia genica mira a fornire un gene terapeutico alle cellule di un paziente. I prodotti di questo nuovo gene possono sostituire l'attività mancante di un gene endogeno carente, inibire un gene tossico, uccidere le ce....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Emory University (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (28-30 giorni di età, massa nell'intervallo di circa 90-135 g, maschi e femmine).
1. Preparazione del vettore
- Scongelare il vettore AAV9 (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio all'inizio della procedura.
- Centrifugare brevemente la provetta per microcentrifuga contenente il vettore in una centrifuga da tavolo per assicurarsi che tutto il liquido si trovi sul fondo della provetta.
- Agitare deli....
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Risultati
Per determinare l'accuratezza della tecnica di iniezione, è stato utilizzato un colorante, il blu di tripano, come surrogato della terapia. Questo colorante si lega facilmente alle proteine, quindi generalmente rimane all'interno della struttura in cui è stato iniettato. Ciò significa che il colorante potrebbe non prevedere con precisione la distribuzione post-iniezione della terapia; Viene semplicemente utilizzato per rivelare l'accuratezza dell'iniezione. Quando viene introdotto con successo nella cisterna lombare, il .......
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Discussione
Un'ampia varietà di malattie colpisce il SNC. Fornire una copia funzionale del gene pertinente tramite un vettore virale è una strategia di trattamento interessante per coloro che sono di natura recessiva e monogenica, come l'atrofia muscolare spinale. Tuttavia, la barriera emato-encefalica (BEE) esclude la maggior parte dei vettori di terapia genica somministrati per via endovenosa11. Quelli che possono attraversare la BEE, come l'AAV9, devono essere somministrati in dosi elevate per superare la .......
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Dichiarazioni
Il Dr. Donsante è un inventore di un brevetto in attesa di brevetto riguardante la somministrazione di vettori AAV9 nel liquido cerebrospinale.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi e Lacey Stearman dell'UT Southwestern per una discussione produttiva sulla sfida posta dai ratti giovani per l'iniezione intratecale. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti di Jaguar Gene Therapy (a JLFK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 200 µ Puntali per pipette filtrati | L MidSci | PR-200RK-FL | Virus di pipettaggio |
| AAV9-GFP | Costruttore di vettori | P200624-1005ynr | AAV9 che esprime il vettore GFP |
| Sutura assorbibile con ago rivestito in Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Misura 4 - 0 | McKesson | J422H | Intrecciato Sutura |
| Cuscinetto da banco | VWR | 56616-031 | Chirurgia |
| Cuscinetti isotermici Braintree Scientific, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Mantiene la temperatura corporea |
| Buprenorfina | McKesson | 1013922 | Analgesico |
| Buprenorfina-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Analgesico a rilascio prolungato | |
| Tamponi di cotone | Fisher Scientific | 19-365-409 | Rimozione |
| del sangueTelo, topo, plastica trasparente, 12" x 12", con fenestrazione adesiva | Steris | 1212CPSTF | Telo chirurgico |
| Dumont #5 Pinze | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Pinza Coperta elettrica | CVS Health | CVS Health Series 500 Termoforo extra lungo | |
| Eppendorf Research plus, pipetta a 1 canale, variabile, 20– 200 µ L | Eppendorf | 3123000055 | Pipettaggio del virus |
| Forbici fini | Strumenti per la scienza fine | 14059-11 | Forbici chirurgiche curve |
| Friedman-Pearson Rongeurs Strumenti per | la scienza fine | 16121-14 | Portaaghi per laminectomia |
| Halsey | Strumenti per scienze fini | 12001-13 | Cacciatore per aghi |
| Siringhe per insulina con ago ultrasottile 12,7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | Siringa BD | 328431 | |
| Isoflurano | McKesson | 803250 | Anestetico |
| Salviette isopropanolo | Fisher Scientific | 22-031-350 | Disinfezione della pelle |
| Lidocaina, 1% | McKesson | 239935 | Anestesia locale |
| Provette per microcentrifuga: 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-137 | Caricamento della siringa |
| Povidone-iodio | Fisher Scientific | 50-118-0481 | per disinfezione della pelle |
| - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Porta lama per bisturi |
| Camera di induzione Sure-Seal Braintree | Scientific | EZ-17 | Scatola per anestesia |
| Lama chirurgica Miltex Acciaio al carbonio n. 11 Sterile monouso confezionato singolarmente | McKesson | 4-111 | #11 Lama per bisturi |
| SYSTANE Unguento per gli occhi NOTTURNO | Alcon | Unguento per gli occhi | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Iniezione |
Riferimenti
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685(2023).
- Larkin, H.
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Ristampe e permessi
