Questo protocollo descrive un saggio di giunzione delle estremità extracromosomiche non omologhe (NHEJ) e un saggio di ricombinazione omologa (HR) per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR nelle cellule HEK-293T.
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Articolo metodologico
Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) rappresentano le lesioni del DNA più pericolose, in grado di indurre una sostanziale perdita di informazioni genetiche e la morte cellulare. In risposta, le cellule impiegano due meccanismi primari per la riparazione del DSB: l'unione delle estremità non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR). Quantificare separatamente l'efficienza di NHEJ e HR è fondamentale per esplorare i meccanismi e i fattori rilevanti associati a ciascuno. Il test NHEJ e il test HR sono metodi consolidati utilizzati per misurare l'efficienza dei rispettivi percorsi di riparazione. Questi metodi si basano su plasmidi meticolosamente progettati contenenti un gene della proteina fluorescente verde (GFP) interrotto con siti di riconoscimento per l'endonucleasi I-SceI, che induce DSB. Qui, descriviamo il saggio NHEJ extracromosomico e il saggio HR, che comportano la co-trasfezione di cellule HEK-293T con plasmidi EJ5-GFP/DR-GFP, un plasmide che esprime I-SceI e un plasmide che esprime mCherry. I risultati quantitativi dell'efficienza NHEJ e HR si ottengono calcolando il rapporto tra le cellule GFP-positive e le cellule mCherry-positive, come contato mediante citometria a flusso. A differenza dei saggi cromosomicamente integrati, questi saggi extracromosomici sono più adatti per condurre indagini comparative che coinvolgono più linee cellulari stabili stabili.
Introduzione
Una rottura del doppio filamento di DNA (DSB) è la forma più deleteria di danno al DNA, che può portare a instabilità del genoma, riarrangiamenti cromosomici, senescenza cellulare e morte cellulare se non riparata prontamente1. Due vie ben consolidate, l'unione delle estremità non omologhe (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR), sono riconosciute per la loro efficacia nell'affrontare i DSBdel DNA 2,3. L'HR è considerato un meccanismo privo di errori per la riparazione del DSB, utilizzando sequenze omologhe nel cromatide fratello come modello per ripristinare la co....
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Protocollo
1. Isolamento plasmidico
- Trasformare E. coli competente con i plasmidi EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmide che esprime I-Sce I) e PCI2-HA-mCherry (plasmide che esprime mCherry) (vedi Tabella dei materiali) seguendo il protocollo di trasformazione standard20.
NOTA: PCI2-HA-mCherry può essere sostituito con altri plasmidi che esprimono mCherry o DsRed. - Coltivare l'E. coli trasformato in 500 mL di terreno LB liquido integrato con 100 μg/mL di ampicillina per una notte a 37 °C con agitazione.
- Isolare i plasmidi utilizzando un maxi kit di isolamento plasmid....
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Risultati
Per garantire l'accuratezza dell'analisi NHEJ e HR, è necessaria l'implementazione di un'adeguata strategia di adeguamento retributivo e di gating. Tipicamente, la fluorescenza di mCherry non si manifesta nel rivelatore GFP quando si utilizza un filtro da 530 nm. Tuttavia, nei casi di cellule che presentano un'espressione estremamente elevata di GFP, la fluorescenza GFP può contaminare il rivelatore mCherry quando si utilizza un filtro a 575 nm. Per affrontare queste preoccupazioni, sono stati utilizzati campioni di cont.......
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Discussione
Il metodo qui descritto è stato impiegato in diversi articoli per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Questo metodo è pertinente per chiarire i mecc.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dalla Natural Science Foundation della provincia cinese di Heilongjiang (YQ2022C036) e dalla Graduate Innovation Foundation della Qiqihar Medical University (QYYCX2022-06). Figura 1 prodotta utilizzando MedPeer.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatti da 6 cm | BBI | F611202-9001 | |
| piastre a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Ampicillina | Beyotime | ST007 | Concentrazione di lavoro: 100 μ g/mL |
| DH5&alfa; Cellule competenti | TIANGEN | CB101 | |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| DR-GFP | Addgene | 26475 | |
| EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
| Kit EndoFree Maxi Plasmid | TIANGEN | DP117 | kit alternativo per l'estrazione di plasmidi privi di endotossine può essere utilizzato |
| FACS tubes | FALCON | 352054 | |
| CLARK | FB25015 | siero bovino fetale | |
| BD Biosciences | BD FACSCalibur | ||
| FlowJo V.10.1 | software di analisi alternativo | Treestar | |
| Cellule HEK-293T | Infrastruttura nazionale della risorsa della linea cellulare | 1101HUM-PUMC000091 | |
| Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | possono essere utilizzati reggenti di trasfezione alternativi |
| PBS | Biosharp | BL601A | |
| pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceI che esprime il plasmide |
| PCI2-HA-mCherry | è possibile utilizzare plasmidi alternativi contenenti DsRed | ||
| Tripsina | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
- Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R.
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Ristampe e permessi
