Escherichia coli-baseret komplementationsanalyse til undersøgelse af chaperonfunktionen af varmechokprotein 70
Summary
Denne protokol demonstrerer chaperonaktiviteten af varmechokprotein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-celler tjener som model for analysen, da de har en indfødt, funktionelt nedsat Hsp70, hvilket gør dem modtagelige for varmestress. Den heterologe introduktion af funktionel Hsp70 redder cellernes vækstmangel.
Abstract
Varmechokprotein 70 (Hsp70) er et konserveret protein, der letter foldningen af andre proteiner i cellen, hvilket gør det til en molekylær chaperon. Mens Hsp70 ikke er afgørende for E. coli-celler , der vokser under normale forhold, bliver denne chaperon uundværlig for vækst ved forhøjede temperaturer. Da Hsp70 er meget bevaret, er en måde at studere chaperonfunktionen af Hsp70-gener fra forskellige arter på heterologt at udtrykke dem i E. coli-stammer , der enten mangler Hsp70 eller udtrykker en indfødt Hsp70, der er funktionelt kompromitteret. E. coli dnaK756 celler er ude af stand til at understøtte λ bakteriofag DNA. Desuden udviser deres oprindelige Hsp70 (DnaK) forhøjet ATPase-aktivitet, samtidig med at de viser reduceret affinitet for GrpE (Hsp70-nukleotidbytterfaktor). Som følge heraf vokser E. coli dnaK756-celler tilstrækkeligt ved temperaturer fra 30 ° C til 37 ° C, men de dør ved forhøjede temperaturer (>40 ° C). Af denne grund tjener disse celler som en model til undersøgelse af Hsp70’s chaperonaktivitet. Her beskriver vi en detaljeret protokol for anvendelsen af disse celler til at gennemføre et komplementationsassay, der muliggør undersøgelsen af in cellulo chaperonfunktionen af Hsp70.
Introduction
Varmechokproteiner spiller en vigtig rolle som molekylære chaperoner ved at lette proteinfoldning, forhindre proteinaggregering og vende proteinfejlfoldning 1,2. Varmechokprotein 70 (Hsp70) er en af de mest fremtrædende molekylære chaperoner, der spiller en central rolle i proteinhomeostase 3,4. DnaK er E. coli Hsp70 homolog5.
Forskellige biofysiske, biokemiske og cellebaserede assays er blevet udviklet til at udforske chaperonaktiviteten af Hsp70 og til at screene for inhibitorer rettet mod denne chaperon 6,7,8. Hsp70 er et meget konserveret protein. Af denne grund er flere Hsp70’er af eukaryote organismer, såsom Plasmodium falciparum (malariaens hovedmiddel), rapporteret at erstatte DnaK-funktionen i E. coli 6,9. På denne måde er der udviklet et E. coli-baseret komplementationsassay, der involverer den heterologe ekspression af Hsp70’er i E. coli for at udforske deres cytoprotektive funktion. Typisk involverer dette assay udnyttelsen af E. coli-celler, der enten mangler DnaK, eller som udtrykker en indfødt DnaK, der er funktionelt kompromitteret. Mens DnaK ikke er afgørende for E. coli-vækst under normale forhold, bliver det vigtigt, når cellerne dyrkes under stressende forhold som forhøjede temperaturer eller andre former for stress10,11.
E. coli-stammer, der er udviklet til at studere Hsp70-funktion ved hjælp af et komplementationsassay, omfatter E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr:: Tn10]) og E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-celler producerer en afkortet DnaK, der ikke er funktionel, og som sådan vokser cellerne tilstrækkeligt ved 30 °C, mens stammen er følsom over for kulde og varmestress 12,13. Tilsvarende vokser E. coli dnaK756/BB2362-stammen (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) ikke over 40 °C14,15. E. coli dnaK756-stammen udtrykker en mutant native DnaK (DnaK756) kendetegnet ved tre glycin-til-aspartatsubstitutioner i positionerne 32, 455 og 468, hvilket giver anledning til kompromitterede proteostatiske resultater. Følgelig er denne stamme resistent over for bakteriofag λ DNA14. Derudover udviser E. coli dnaK756 forhøjet ATPase-aktivitet, mens dens affinitet for nukleotidbytterfaktoren, GrpE, reduceres16. E. coli DnaK-mutantstammer tjener som ideelle modeller til undersøgelse af Hsp70’s chaperonaktivitet gennem en komplementationstilgang. Da DnaK kun er afgørende under stressende forhold, udføres komplementationsanalysen typisk ved forhøjede temperaturer (figur 1). Nogle fordele ved at bruge E. coli til denne undersøgelse omfatter dets velkarakteriserede genom, hurtig vækst og de lave omkostninger ved dyrkning og vedligeholdelse17.
I denne artikel beskriver vi detaljeret en protokol, der involverer brugen af E. coli dnaK756-celler til at studere funktionen af Hsp70. De HSP70’ere, vi anvendte i analysen, er vildtype DnaK og dets kimære derivat, KPf (bestående af ATPase-domænet for DnaK smeltet sammen med det C-terminale substratbindende domæne af Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F blev heterologt udtrykt som en negativ kontrol, da mutationen i det væsentlige blokerer den fra bindende substrater og dermed ophæver dens chaperonaktivitet9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen demonstrerer nytten af E. coli dnaK756-cellertil at udforske chaperonfunktionen af heterologt udtrykt Hsp70. Dette assay kunne anvendes til screening af hæmmere rettet mod Hsp70-funktionen i cellulo. En begrænsning ved denne metode er imidlertid, at Hsp70’er, der ikke er i stand til at erstatte DnaK i E. coli , ikke er kompatible med dette assay. Manglende posttranslationel modifikation21 af nogle ikke-indfødte Hsp70’er kan forklare deres manglende funktio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet med tilskudsmidler fra International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) bevillingsnummer, HDI / CRP / 012, Forskningsdirektoratet ved University of Venda, bevilling I595, Institut for Videnskab og Innovation (DSI) og National Research Foundation (NRF) i Sydafrika (bevillingsnumre, 75464 &; 92598) tildelt AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
