Test di complementazione basato su Escherichia coli per studiare la funzione chaperone della proteina da shock termico 70

Sommario

Questo protocollo dimostra l'attività chaperone della proteina da shock termico 70 (Hsp70). Le cellule dnaK756 di E. coli fungono da modello per il test in quanto ospitano un Hsp70 nativo e funzionalmente compromesso, che le rende suscettibili allo stress termico. L'introduzione eterologa di Hsp70 funzionale salva il deficit di crescita delle cellule.

Abstract

La proteina da shock termico 70 (Hsp70) è una proteina conservata che facilita il ripiegamento di altre proteine all'interno della cellula, rendendola uno chaperone molecolare. Mentre Hsp70 non è essenziale per le cellule di E. coli che crescono in condizioni normali, questo chaperone diventa indispensabile per la crescita a temperature elevate. Poiché Hsp70 è altamente conservato, un modo per studiare la funzione chaperone dei geni Hsp70 di varie specie è quello di esprimerli eterologamente in ceppi di E. coli che sono carenti di Hsp70 o che esprimono un Hsp70 nativo che è funzionalmente compromesso. Le cellule dnaK756 di E. coli non sono in grado di supportare il DNA del batteriofago λ. Inoltre, il loro Hsp70 nativo (DnaK) mostra un'elevata attività ATPasica mentre dimostra una ridotta affinità per GrpE (fattore di scambio nucleotidico Hsp70). Di conseguenza, le cellule di E. coli dnaK756 crescono adeguatamente a temperature comprese tra 30 °C e 37 °C, ma muoiono a temperature elevate (>40 °C). Per questo motivo, queste cellule fungono da modello per lo studio dell'attività chaperone di Hsp70. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'applicazione di queste cellule per condurre un saggio di complementazione, consentendo lo studio della funzione chaperone nella cellulo di Hsp70.

Introduzione

Le proteine da shock termico svolgono un ruolo importante come chaperoni molecolari facilitando il ripiegamento delle proteine, prevenendo l'aggregazione proteica e invertendo il misfolding proteico ^1,2. La proteina da shock termico 70 (Hsp70) è uno dei più importanti chaperoni molecolari, che svolge un ruolo centrale nell'omeostasi proteica ^3,4. DnaK è l'omologo⁵ di E. coli Hsp70.

Sono stati sviluppati vari saggi biofisici, biochimici e cellulari per esplorare l'attività chaperone di Hsp70 e....

Protocollo

1. Trasformazione

NOTA: Utilizzare vetreria sterile per coltura, puntali per pipette e terreni appena preparati e sterilizzati in autoclave. Preparare colture di cellule di E. coli in 2x triptone di lievito (YT) [1,6% triptone (p/v), 1% estratto di lievito (p/v), 0,5% NaCl (p/v), 1,5% agar (p/v)] agar. I reagenti generali utilizzati nel protocollo e le loro fonti sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Etichettare le provette per microcentrifuga da 2,0 mL e aliquotare 50 μL di cellule dnaK756 di E. colicompetenti, mantenendo le cellule in ghiaccio.
2. Alle provette per m....

Risultati

La Figura 2 presenta un'immagine dell'agar scansionato contenente cellule che sono state individuate e coltivate alla temperatura di crescita permissiva di 37 °C e 43,5 °C, rispettivamente. Sul lato destro della Figura 2, i componenti western blot asportati rappresentano l'espressione di DnaK, KPf e KPf-V436F nelle cellule dnaK756 di E. coli. Come previsto, tutte le cellule di E. coli dnaK756 coltivate alla temperatura di crescita permissiva di.......

Discussione

Il protocollo dimostra l'utilità delle cellule dnaK756 di E. colinell'esplorare la funzione chaperone di Hsp70 espressa eterologamente. Questo test potrebbe essere adottato per lo screening di inibitori che mirano alla funzione di Hsp70 nella cellulo. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che gli Hsp70 che non sono in grado di sostituire il DnaK in E. coli non sono compatibili con questo test. La mancanza di modificazione post-traduzionale²¹ di alcuni Hsp70 non na.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-β-Mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	8,05,740	Costituente per il caricamento del campione
colorante Acido acetico	Labchem	101005125	Costituente del decoloratore
Acrilammide	Sigma-Aldrich	8008300100	Componente di SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Costituente del saggio di crescita medio e liquido
Agarosio	Clever Scientific	14131031	Biologia molecolare certificata agarosio
Persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	101875295	Costituente per gel SDS-PAGE
Ampicillina	VWR International	0339—EU— 25G	Antibiotico selettivo
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Componente di SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Costituente per il colorante di caricamento dei campioni
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Per una preparazione competente delle cellule
Coomassie blu brillante	VWR International	443293X	Colorante SDS-PAGE
Fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	RB10368	Costituente del tampone PBS
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Reagente per la rilevazione di Western blot
Bromuro di etidio	Thermofischer Scientific	17898	Colorante intercalante del DNA
Glicerolo	Merck	SAAR2676520L	Costituente per il caricamento del campione
Colorante Glicina	VWR International	10119CU	Componente di SDS
IPTG	Glentham scienze della vita	162IL	induttore
Kanamicina	Melford	K0126	Antibiotico selettivo
Cloruro di magnesio	Merck	SAAR4123000EM	Costituente del test di crescita medio e liquido
Metanolo	Labchem	113140129	Costituente del decoloratore
Fosfato di potassio monobasico	Merck	1,04,87,30,250	Costituente del tampone PBS
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Costituente del saggio di crescita medio e liquido
Cloruro di potassio	Merck	SAAR5042020EM	Costituente del tampone PBS
Membrana PVDF	Thermofischer scientific	PB7320	Membrana Western blot
Cloruro di sodio	Merck	SAAR5822320EM	Costituente del saggio di crescita medio e liquido
Dodecil solfato di sodio	VWR International	108073	Per risolvere le proteine espresse
Spectramax iD3	Separazioni	373705019	Lettore automatico di piastre
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Componente del gel SDS
Tetraciclina	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Antibiotico selettivo
Tris	VWR International	19A094101	Componente del gel SDS
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Costituente per il tampone di lavaggio occidentale
Camera di trasferimento occidentale	Thermofisher Scientific	PB0112	Trasferimento di proteine alla membrana di nitrocellulosa
Estratto di lievito	Merck	HG000BX6.500	Costituente del saggio di crescita medio e liquido
&alfa;-DnaK anticorpo	Inqaba	BK CAC09317	Anticorpo primario
&alfa;-coniglio	Thermofischer scientific	31460	Anticorpo secondario