Ensaio de Complementação Baseado em Escherichia coli para Estudo da Função Chaperone da Proteína de Choque Térmico 70

Summary

Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.

Abstract

A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma proteína conservada que facilita o enovelamento de outras proteínas dentro da célula, tornando-a uma chaperona molecular. Enquanto Hsp70 não é essencial para células de E. coli crescendo em condições normais, esta chaperona torna-se indispensável para o crescimento em temperaturas elevadas. Uma vez que a Hsp70 é altamente conservada, uma maneira de estudar a função de chaperona de genes de Hsp70 de várias espécies é expressá-los heterologamente em cepas de E. coli que são deficientes em Hsp70 ou expressam uma Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. As células de E. coli dnaK756 são incapazes de suportar o DNA do bacteriófago λ. Além disso, sua Hsp70 nativa (DnaK) exibe atividade ATPase elevada, enquanto demonstra afinidade reduzida por GrpE (fator de troca de nucleotídeos Hsp70). Como resultado, as células de E. coli dnaK756 crescem adequadamente em temperaturas que variam de 30 °C a 37 °C, mas morrem em temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razão, essas células servem de modelo para o estudo da atividade de chaperona da Hsp70. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a aplicação dessas células na realização de um ensaio de complementação, possibilitando o estudo da função da chaperona in cellulo da Hsp70.

Introduction

As proteínas de choque térmico desempenham um papel importante como chaperonas moleculares, facilitando o enovelamento de proteínas, prevenindo a agregação proteica e revertendo o mau enovelamento de proteínas ^1,2. A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma das chaperonas moleculares mais proeminentes, desempenhando um papel central na homeostase proteica ^3,4. DnaK é o homólogo 5 de E. coli Hsp70^.

Vários ensaios biofísicos, bioquímicos e baseados em células foram desenvolvidos para explorar a atividade de chaperona de Hsp70 e rastrear inibidores direcionados a essa chaperona ^6,7,8. Hsp70 é uma proteína altamente conservada. Por essa razão, vários Hsp70s de organismos eucarióticos, como o Plasmodium falciparum (o principal agente da malária), têm sido relatados para substituir a função DnaK em E. coli ^6,9. Desta forma, um ensaio de complementação baseado em E. coli foi desenvolvido envolvendo a expressão heteróloga de Hsp70s em E. coli para explorar sua função citoprotetora. Normalmente, este ensaio envolve a utilização de células de E. coli que são deficientes para DnaK ou que expressam um DnaK nativo que está funcionalmente comprometido. Embora a DnaK não seja essencial para o crescimento de E. coli em condições normais, ela se torna essencial quando as células são cultivadas sob condições estressantes, como temperaturas elevadas ou outras formas de estresse^10,11.

Cepas de E. coli que foram desenvolvidas para estudar a função Hsp70 usando um ensaio de complementação incluem E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) e E. coli dnaK756. As células dnaK103 de E. coli produzem um DnaK truncado que não é funcional e, como tal, as células crescem adequadamente a 30 °C, enquanto a cepa é sensível ao estresse térmico e ao frio^12,13. Da mesma forma, a cepa de E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) não cresce acima de 40 °C^14,15. A cepa de E. coli dnaK756 expressa um DnaK nativo mutante (DnaK756) caracterizado por três substituições de glicina para aspartato nas posições 32, 455 e 468, dando origem a resultados proteostáticos comprometidos. Consequentemente, essa cepa é resistente ao DNA λ do bacteriófago¹⁴. Além disso, E. coli dnaK756 exibe elevada atividade da ATPase, enquanto sua afinidade pelo fator de troca de nucleotídeos, GrpE, é reduzida¹⁶. E. coli Linhagens mutantes de DnaK servem como modelos ideais para investigar a atividade de chaperona de Hsp70 através de uma abordagem de complementação. Como a DnaK só é essencial sob condições estressantes, o ensaio de complementação é tipicamente conduzido em temperaturas elevadas (Figura 1). Algumas vantagens do uso de E. coli para este estudo incluem seu genoma bem caracterizado, crescimento rápido e baixo custo de cultivo e manutenção¹⁷.

Neste artigo, descrevemos em detalhes um protocolo envolvendo o uso de células de E. coli dnaK756 para estudar a função da Hsp70. As Hsp70s que empregamos no ensaio são DnaK selvagens e seu derivado quimérico, KPf (composto pelo domínio ATPase da DnaK fundido ao domínio C-terminal de ligação ao substrato C-terminal Hsp70-1 ^6,18). O KPf-V436F foi heterologamente expresso como um controle negativo, uma vez que a mutação essencialmente o bloqueia de substratos de ligação, revogando assim sua atividade de chaperona⁹.

Protocol

1. Transformação OBS: Utilize vidraria estéril para cultura, ponteiras de pipeta e meios recém-preparados e autoclavados. Preparar culturas das células de E. coli em ágar 2x triptona de levedura (YT) [1,6% triptona (p/v), 1% extrato de levedura (p/v), 0,5% NaCl (p/v), 1,5% ágar (p/v)]. Os reagentes gerais utilizados no protocolo e suas fontes são fornecidos na Tabela de Materiais. Rotular tubos de microcentrífuga de 2,0 mL e alíquo…

Representative Results

A Figura 2 apresenta a imagem do ágar escaneado contendo células que foram manchadas e cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C e 43,5 °C, respectivamente. No lado direito da Figura 2, os componentes do western blot excisados representam a expressão de DnaK, KPf e KPf-V436F em células de E. coli dnaK756. Como esperado, todas as células de E. coli dnaK756 cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C co…

Discussion

O protocolo demonstra a utilidade das células dnaK756 de E. colina exploração da função chaperona de Hsp70 heterologamente expressa. Este ensaio pode ser adotado para rastrear inibidores visando a função de Hsp70 em celulose. No entanto, uma limitação deste método é que Hsp70s incapazes de substituir DnaK em E. coli não são compatíveis com este ensaio. A falta de modificação pós-traducional²¹ de algumas Hsp70s não-nativas pode explicar sua falta de fun?…

Materials

2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody