Summary
Her præsenteres en suspension HEK293 cellebaseret AAV-produktionsprotokol, hvilket resulterer i reduceret tid og arbejdskraft, der er nødvendig til vektorproduktion ved hjælp af komponenter, der er tilgængelige til forskningsformål fra kommercielle leverandører.
Abstract
Adeno-associerede virale vektorer (AAV'er) er et bemærkelsesværdigt værktøj til undersøgelse af centralnervesystemet (CNS). Innovative kapsler, såsom AAV. PHP.eB, demonstrere omfattende transduktion af CNS ved intravenøs injektion hos mus. For at opnå sammenlignelig transduktion er der behov for en 100 gange højere titer (mindst 1 x 1011 genomkopier/mus) sammenlignet med direkte injektion i CNS-parenkymet. I vores gruppe, AAV produktion, herunder AAV. PHP.eB er afhængig af klæbende HEK293T celler og den tredobbelte transfektionsmetode. Opnåelse af høje udbytter af AAV med klæbende celler indebærer en arbejds- og materialeintensiv proces. Denne begrænsning førte til udviklingen af en protokol til suspensionsbaseret cellekultur i koniske rør. AAV'er genereret i vedhængende celler blev sammenlignet med suspensionsproduktionsmetoden. Kultur i suspension ved anvendelse af transfektionsreagenser Polyethylenimin eller TransIt blev sammenlignet. AAV-vektorer blev renset ved iodixanolgradient ultracentrifugering efterfulgt af bufferudveksling og koncentration under anvendelse af et centrifugalfilter. Med den vedhængende metode opnåede vi i gennemsnit 2,6 x 1012 genomkopier (GC) i alt, mens suspensionsmetoden og polyethylenimin gav 7,7 x 1012 GC i alt, og TransIt gav 2,4 x 1013 GC i alt. Der er ingen forskel i in vivo-transduktionseffektivitet mellem vektorer produceret med klæbende sammenlignet med suspensionscellesystemet. Sammenfattende introduceres en suspension HEK293-cellebaseret AAV-produktionsprotokol, hvilket resulterer i en reduceret mængde tid og arbejdskraft, der er nødvendig til vektorproduktion, samtidig med at der opnås 3 til 9 gange højere udbytter ved hjælp af komponenter, der er tilgængelige fra kommercielle leverandører til forskningsformål.
Introduction
Adeno-associeret virus (AAV) blev opdaget i 1965 og er siden blevet brugt i et utal af applikationer1. AAV'er er blevet anvendt i neurovidenskabelig forskning til at studere gen- og neuronal funktion, kortlægge neurokredsløb eller producere dyremodeller for sygdom2. Traditionelt gøres dette ved at injicere direkte på det interessante sted, da de fleste naturlige serotyper ikke krydser blod-hjerne-barrieren eller har brug for en høj dosis for at gøre det 1,2,3.
Med opdagelsen af AAV. PHP.B4 og næste generations kapsider som AAV. PHP.eB5 og AAV. CAP-B106, er det muligt at målrette centralnervesystemet (CNS) ved hjælp af en simpel systemisk injektion. Rumlig kortlægning afslører de celler, der er målrettet mod AAV. PHP.eB på mobilniveau 6,7. I kombination med specifikke promotorer / forstærkere giver disse kapsider omfattende muligheder for neuroforskere til at studere gener og hjernefunktion ved ikke-invasiv AAV-levering 4,8.
Mens en lavere dosis er nødvendig for AAV. PHP.eB (typisk 1 til 5 x 1011 genomkopier (GC) / mus) sammenlignet med AAV9 (4 x10 12 GC / mus)7, skal der produceres stadig mere vektor sammenlignet med direkte injektionsstrategier (typisk 1 x 109 GC / μL injektion). De fleste naturlige serotyper kan fremstilles ved hjælp af det klassiske klæbende cellekultursystem i kombination med iodixanolrensning 9,10,11,12. For AAV. PHP.eB dette indebærer en arbejdskrævende proces til dyrkning og transfektering af celler for at opnå tilstrækkelige vektorer til et eksperiment8. Derfor blev produktionen af AAV i suspensionscellekultur i koniske rør udviklet. Koniske rør med en kapacitet på op til 300 ml er kompakte, hvilket sparer både inkubatorplads og plast. Suspensionsceller er meget lettere at dyrke og håndtere i store mængder end klæbende celler på 15 cm plader. Transfektionskomponenterne i protokollen forbliver de samme. Derfor kan plasmider, der tidligere er anvendt med det klæbende system, let anvendes i denne protokol baseret på produktion i suspensionsceller. Protokollen blev med succes overført til andre forskere i laboratoriet og med succes anvendt til forskellige kapsider og konstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af det kongelige nederlandske videnskabsakademis (KNAW) institutionelle udvalg for dyrepleje og brug og var i overensstemmelse med den hollandske lov om dyreforsøg under projektnummer AVD8010020199126. I figur 1 gives en skematisk oversigt over den komplette protokol. Fra såning af celler til AAV-oprensning tager protokollen 6 dage at gennemføre.
1. Fremstilling af reagens
- Oprensning af plasmid
- Udfør plasmidekstraktion som beskrevet af producenten med nogle få justeringer for at sikre plasmidernes sterilitet.
- Forbered 70% ethanol ved hjælp af sterilt destilleret vand og absolut ethanol.
- Efter isopropanolcentrifugeringstrinnet tørres plasmider i strømningsskabshætten og tilsættes steril 70% ethanol til rørene. Efter ethanoludfældning tørres plasmiderne i strømningsskabshætten og resuspenderes plasmidet i sterilt destilleret vand. Pas på at bruge steriliserede mikrocentrifugerør.
- Tag en prøve til kvantificering, restriktionsanalyse og om nødvendigt sekventering. Det tilrådes at kontrollere integriteten af de inverterede terminalgentagelser (ITR'er), da mutationer kan have en negativ indvirkning på udbyttet. Prøvekoncentrationen justeres til 1 μg/μL.
- Fremstilling af 10x Tween lysis buffer
- 30,3 g Tris buffer og 2,033 g MgCl2,6H 2O opløses i 400 ml sterilt destilleret vand, pH indstilles til 8,0, og det samlede volumen øges til 450 ml.
- Hold Tween 20 steril, tilsæt 50 ml Tween 20 til bufferopløsningen i emhætten, og filtrer steriliser ved hjælp af et 0,2 μM vakuumfilter.
- Iodixanol fortyndinger
- Iodixanolopløsning tilvejebringes ved 60% koncentration. Brug startløsningen til at lave 15%, 25% og 40% løsninger.
- Til 15% opløsning fortyndes 60 ml 60% opløsning med 48 ml 5 M NaCl og 48 ml PBS-MK (5x PBS med 5 mM MgCl2 og 12,5 mM KCl), og der tilsættes destilleret vand op til 240 ml.
- For 25% opløsning fortyndes 67 ml 60% opløsning og 32 ml PBS-MK. Tilsæt destilleret vand op til 160 ml. Bland godt og tilsæt 1,6 ml phenolrød opløsning.
- Til 40% opløsning fortyndes 160 ml 60% opløsning med 48 ml PBS-MK og tilsættes destilleret vand op til 240 ml. Til 60% opløsning tilsættes 1 ml phenolrød til 100 ml 60% opløsning.
- PBS 5% saccharoseopløsning
- Tilsæt 25 g saccharose til en 500 ml flaske DPBS uden calcium eller magnesium. Ryst godt og filtrer ved hjælp af et 0,2 μM flaskevakuumfilter.
- Polyethylenglycol (PEG) 8000 opløsning
- 400 g PEG 8000 og 24 g NaCl opløses i sterilt destilleret vand og indstilles til et slutvolumen på 1000 ml. Rør med opvarmning, indtil den er helt opløst. Juster pH til 7,4 ved hjælp af pH-papir.
- Filtersteriliser ved hjælp af et 0,2 μM flaskevakuumfilter for at opnå en 40% PEG 8000-opløsning. Bemærk, at filtreringen vil tage et stykke tid på grund af opløsningslagerets viskositet ved 4 °C.
2. Kultur af HEK293 suspensionsceller
- Brug klude gennemblødt i 70% ethanol til rengøring. Rengør biosikkerhedshætten, forbered og rengør alle materialer, der er nødvendige til dyrkning af celler.
- Forvarm 30 ml suspensionscellemedium til 37 °C i et 50 ml konisk dyrkningsrør. Hent virale produktionsceller fra flydende nitrogen. Cellerne tøs hurtigt op i et 37 °C vandbad. Lige før hætteglasset er helt optøet, rengøres det med en serviet gennemvædet i 70% ethanol og overfør hætteglasset til biosikkerhedshætten.
BEMÆRK: Detaljerne om de virale produktionsceller, der anvendes her, findes i materialetabellen. - Overfør hurtigt celler til det forvarmede 50 ml koniske dyrkningsrør. Kulturceller i en rysteinkubator ved 37 °C, 80% fugtighed, 8% CO2, 200 omdrejninger pr. Minut (RPM) og en rystediameter på 50 mm. Passageceller, når levedygtigheden er over 90% og celletætheden er over 1-3 x 106 celler / ml.
BEMÆRK: Den anvendte inkubator har en rystediameter på 50 mm; Kulturbetingelserne bør justeres for en anden rystediameter. - Passage celler 3-4 dage efter optøning. Kontroller dyrkningsrør for at sikre, at der ikke er tegn på kontaminering; For eksempel vises svamp som en misfarvet (sort eller grøn) ring.
- Forbered 400 μL 0,4% trypanblå opløsning pr. prøve ved hjælp af en 1 ml stripette.
- Hent hurtigt suspensionsceller fra inkubatoren. Udtræk straks 500 μL fra røret ved hjælp af en 1 ml stripette. Pipet forsigtigt op og ned.
- Tilsæt 100 μL cellesuspension til det fremstillede trypanblå rør. Vend forsigtigt røret for at blande; pipet ikke for at blande, da dette vil føre til celledød. Returner celler til inkubator.
- Tag 50 μL trypanblåbehandlet cellesuspension og påfør den på hæmocytometerobjektglasset. Tæl det samlede antal levedygtige celler, og beregn mængden af cellesuspension og medium, der er nødvendigt til passage eller transfektion den følgende dag.
- Varmt medium i inkubatoren i 10-15 min. Tilsæt cellesuspension til opvarmet medium og vend tilbage til inkubator. For passerende celler i 3 dage (dvs. mandag-torsdag), indstillet til 0,5 x 106 celler / ml; for passerende celler i 4 dage (dvs. torsdag-mandag), indstillet til 0,3 x 106 celler / ml.
BEMÆRK: Ifølge producenten fordobles virale produktionsceller hver 26. time og skal være mellem 3,5 x 106 og 5,5 x 106 før passering. Celler kan opbevares i op til passage 20.
3. Transfektion
- Dag 1
- Ved 24 timer før transfektion, kultur 1 x 106 celler pr. / ml i 300 ml medier.
- Dag 2
- Varmt medium, plasmider og transfektionsreagens til stuetemperatur. Med hensyn til de beløb, der skal forberedes, henvises til tabel 1.
- Kort hvirvelplasmider og reagenser. Tilsæt plasmider til det forberedte medium, hvirvel. Tilsæt transfektionsreagens og hvirvel kort. Omrør ikke blandingen efter dette trin. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
- I mellemtiden tælles celler forberedt på dag 1. Celler skal være mellem 2 og 2,5 x 106 celler pr. ml og > 95% levedygtige.
- Efter inkubation, dråbevis, tilsæt transfektionsblandingen til celler, mens du forsigtigt hvirvler røret. Inkuber i 72-96 timer.
4. Høstning af cellerne
- Dag 5
- Der tilsættes 33 ml 10x cellelysebuffer (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), blandes ved forsigtig omrystning og inkuberes ved 37 °C i 1,5 time under omrystning.
- Der centrifugeres ved 3428 x g ved 4 °C i 60 min. Filtrer gennem et 0,45 μM PES vakuumfilter for at klarlægge cellelysatet, og lad det klarede lysat være i filterbeholderen.
BEMÆRK: Valgfrit efter filtrering: Udtag 50 μL prøve til kvantitativ PCR (Q-PCR). - Tilsæt 90 ml 40% PEG 8000-opløsning til 360 ml filtreret cellelysat.
- Rengør omrøringsstangen med 70% ethanol og tilsæt prøven. Rør på is eller i kølerummet ved 300 RPM i 1 time. Der inkuberes ved 4 °C uden omrøring natten over.
BEMÆRK: Inkubationstider på 1 time til 72 timer er blevet testet. Længere inkubationstider har en negativ effekt på den samlede proteinudfældning.
5. Iodixanol oprensning
- Dag 6
- Hele den udfældede PEG-kulturvolumenprøve overføres til et rent, stort konisk rør, og centrifugeres ved 2820 x g og 4 °C i 15 minutter.
- Supernatanten kasseres, og PEG-pelletten opslæmmes i 15 ml DPBS med calcium og magnesium. Pelleten er vanskelig at resuspendere; Tag dig tid til at gøre dette omhyggeligt.
- Overfør den ophængte del til et rent 50 ml rør. PEG forbliver på siderne af bioreaktorrøret. Tilsæt yderligere 10 ml, og sørg for at samle alt PEG-bundfaldet. Overfør alt til en 50 ml beholder til et samlet volumen på 25-30 ml.
- Der tilsættes 40 μL DNaseI (10 E/μL). Anbring i inkubatoren i 1 time og 37 ° C.
BEMÆRK: Valgfrit efter inkubation af DNase: Udtag 50 μL prøve for Q-PCR. - Rengør omrøringsstænger, der blev brugt til PEG-udfældning, godt med chloridopløsning efterfulgt af 70% ethanol. Lad omrøringsstængerne være i 70% ethanol til næste forsøg.
- Fyld et 25 mm x 89 mm polyallomerrør med en Pasteur-pipette af glas med 15,5 ml koncentreret cellelysat i hvert rør. Efter tilsætning af cellelysat skal du udskifte glaspasteurpipetten med en ny.
- Tilsæt iodixanolopløsninger fra 15% -60%: infundere 9 ml af 15% iodixanolopløsningen forsigtigt under cellelysatet. Derefter tilsættes 5 ml af 25% og 40% iodixanolopløsningerne, og til sidst tilsættes 5 ml af 60% iodixanolopløsningen.
- Top røret ved hjælp af en sprøjte med DPBS +/+ for at fjerne de fleste luftbobler, pas på ikke at forstyrre iodixanollag. Forsegl røret ved hjælp af en elektrisk rørtopper.
- Centrifuger i en ikke-svingrotor i 1 time og 10 min ved 490.000 x g ved 16 °C i en ultracentrifuge. Fjern fra ultracentrifugen, saml rørene i en metallås, og forbered opsamlingsrør. Åbn rotoren i emhætten i tilfælde af spild under centrifugering.
- Forbered et 50 ml rør (til kassering af rotorrøret), et 15 ml rør (til opsamling af virus), en 5 ml sprøjte og en 30G og 19G nål pr. gradient.
- Punktering et hul i toppen af røret med en 30G nål. Lad kanylen sidde på plads. Anbring en 19G kanyle på sprøjten.
- Punktering forsigtigt røret lige under 40%/60% grænsefladen, som kan ses af den phenolrøde indikator. Sørg for, at nålefacetten vender mod 40%-laget.
- Fjern 30G nålen fra toppen af tuben ved hjælp af den ikke-dominerende hånd. Med nålen, ekstraheres langsomt virus/iodixanol. Målet er at udvinde mellem 3 ml og 4,5 ml. Omkring halvvejs og et godt stykke ind i det 40% / klare lag drejes nålen, så skråningen vender nedad og fortsætter med at trække sig ud for at undgå opsamling fra proteinlaget.
- Klargør 50 ml røret med den ikke-dominerende hånd, træk forsigtigt kanylen ud, mens du placerer tuben i 50 ml røret og kassér det. AAV/iodixanolsuspensionen fortyndes 5x i DPBS ved at fylde op til 15 ml.
- Overfør til et centrifugalfilterrør og centrifuger ved 3428 x g, 4 °C i 10 minutter. Kassér gennemstrømning; Fjern forsigtigt filterholderen, og tip bundbeholderen i en affaldsflaske. Tilsæt 15 ml PBS-5% saccharose for at filtrere og resuspendere.
- Der centrifugeres ved 3428 x g ved 4 °C i 20 minutter. Gentag bufferudskiftning mindst 3x. Opbevar virus (~150-250 μL) ved 4 °C (PHP. B-varianter højst 3 måneder) eller alikvote til 50 μL delprøver og opbevares ved -80 °C i lang tid.
BEMÆRK: PHP. B-capsidvarianter er følsomme over for frysning / optøning, så dette bør undgås. - Udfør titrering som beskrevet i en tidligere protokol10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fleste akademiske laboratorier bruger klæbende HEK293T celler til AAV-produktion 8,9. Selvom dette fungerer relativt godt, når der er behov for små mængder AAV til direkte injektion, er en 100 gange højere titer (minimalt 1 x 1011 GC/mus) nødvendig for at opnå lignende transduktion med systemiske kapsider såsom AAV. PHP.eB.
I denne protokol blev produktionen af AAV ved anvendelse af suspension HEK293-celler dyrket i koniske rør etableret. Små kulturer kan udføres i 50 ml rør og storskala i 600 ml rør. Til specifikke rystere (se materialetabellen) kan der anvendes et stativ, hvor op til 16 store rør kan dyrkes samtidigt. Dette stativ bruges i kombination med specielle indsatser til 50 ml rør (figur 2A). Dette system giver en betydelig tidsgevinst for denne protokols dyrknings- og transfektionssegment. Den indledende opsætning af produktionen blev udført med reporterkonstruktioner til luciferase og grønt fluorescerende protein (GFP)10,11. Parallelt blev GFP-konstruktionen produceret i 12, 15 cm2 plader som beskrevet i en tidligere offentliggjort protokol12. I gennemsnit blev der opnået et udbytte på 7,7 x 1012 GC i alt ved anvendelse af polyethylenimin (PEI) og 2,4 x 1013 GC ved anvendelse af TransIt (figur 2B). For PEI er dette en næsten 3 gange forbedring; for TransIt er det en 9,2 gange forbedring i forhold til titere opnået med klæbende kultur (2,6 x 1012). Når det bruges til at transfektere suspensionsceller, giver TransIt ca. en 3 gange forbedring i udbytte sammenlignet med PEI (figur 2B).
Derefter blev AAV-vektorernes ydeevne testet in vivo. GFP-vektorer blev produceret med PEI og TransIt og sammenlignet med GFP-vektorer produceret med det klassiske klæbende system. 4 uger efter injektion blev mus (6 uger C57BL/6 hunmus, der vejer 20-25 g) ofret, og GFP-ekspression i musens hjerner blev evalueret ved histologi (figur 3A). Sammenlignende analyse blev udført på sagittale hjernesektioner. Der blev ikke observeret nogen forskel i transduktionsmønstret for det virus, der blev fremstillet ved hjælp af disse produktionsmetoder (figur 3B). Luciferaseaktiviteten af vektorerne produceret ved hjælp af begge metoder blev også vurderet. Transduktion blev målt in vivo i 3 uger; ekspressionsmønsteret over tid er ens, uanset hvilket transfektionsreagens der anvendes (figur 4).
Derefter blev protokollen testet og implementeret af andre medlemmer af teamet (tabel 2). Produktionen af andre kapsider med PEI var vellykket, hvilket gav et gennemsnitligt udbytte på 3,5 x 1012 GC vektorer. For capsid B10-produktion kan der opnås en 3-dobbelt forbedring ved at bruge TransIt versus PEI. For et andet projekt gav flere konstruktioner pakket i AAv.PHP.eB et gennemsnitligt udbytte på 3,7 x 1012, hvilket er nok til at injicere 7 mus intravenøst i en dosis på 5 x 1011 GC pr. Mus. Disse resultater illustrerer, at protokollen med succes kan bruges af flere forskere til forskellige kapsider og konstruere kombinationer.
Figur 1: Skematisk oversigt over produktionen. På dag 1 (D1) dyrkes celler i 300 ml rør. På dag 2 (D2) transfekteres celler med de relevante plasmider. På dag 5 (D5) høstes og lyseres celler ved hjælp af en 10x tween lysisbuffer. Efter lysis fjernes celleaffald ved centrifugering. Derefter filtreres cellelysatet for at fjerne store proteiner, og AAV-viruset udfældes under anvendelse af polyethylenglycol (PEG) 8000. På dag 6 (D6) udføres iodixanolrensning og koncentration. PEG-koncentratet fra den foregående dag behandles med DNase og placeres derefter gennem en iodixanolgradient. De rensede vektorer afsaltes efterfølgende og koncentreres ved hjælp af et centrifugalfilter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Inkubatoropsætning og AAV-udbytter. (A) Virale produktionsceller dyrkes i en rystende inkubator med en rystediameter på 50 cm. Denne inkubator er udstyret med en adapterplade til 600 ml rør og specielle indsatser til 50 ml rør produceret af mekatronikafdelingen. (B) Efter den indledende opsætning konstruerer reporteren enten polyethyleneimin (PEI; 7,7 x 1012 GC i alt, n = 5) eller TransIt (2,4 x 1013 GC i alt, n = 5) som transfektionsmetode og sammenlignet med de udbytter, der opnås med den klassiske vedhængende metode (2,6 x 1012 GC i alt, n = 5) som beskrevet i Verhaagen et al.12. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: GFP-ekspressionsmønster efter in vivo-evaluering . (A) Skematisk afbildning af en typisk AAV-vektorkonstruktion, der indeholder den allestedsnærværende promotor CMV immediate-early enhancer, kylling β-actin promotor og kanin β-Globin splejsningsacceptor site (CAG) efterfulgt af grønt fluorescerende protein (GFP), Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) og en polyadenyleringshale (pA)13. Her fik 6 uger gamle hunmus (n=3) en haleveneinjektion indeholdende 5 x 1011 samlede genomiske kopier (gc)/mus. 4 uger efter injektion blev mus ofret, og hjerner blev analyseret ved histologi. (B) Repræsentativ afbildning af transduktionsmønsteret i sagittale sektioner ved anvendelse af klæbende HEK293T celler og suspensionsceller med polyethyleneimin (PEI) eller TransIt-transfektionsreagens, observeres et lignende transduktionsmønster uanset den anvendte produktionsmetode. Skalabjælke = 1000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Lignende luciferaseaktivitet uanset transfektionsmetode. (A) Skematisk afbildning af den anvendte konstruktion indeholdende den allestedsnærværende promotor CMV immediate-early enhancer, kylling β-actin promotor og kanin β-Globin splejsningsacceptor site (CAG) luciferase (LUC) med et V5-mærke og en bovin væksthormonpolyadenyleringshale (BGHpA), 5 x10 11 GC total/mus (n = 3) blev injiceret via halevenen, luciferase aktivitet i kranieområdet (cirklet i rødt, i eksempel billede) som bioluminescerende billede blev målt ugentligt. (B) Bioluminescerende aktivitet blev målt som relative luminescensenheder (RLU) afbildet som en blå bjælke for PEI-produktion og en brun bjælke for TransIt. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i luciferaseaktivitet i det valgte hjerneområde mellem grupperne. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Transfektionsparametre. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Udbytte af den implementerede protokol. Suspensionsprotokol, der bruges af andre forskere til at producere AAV. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systemisk administration af AAV er et kraftfuldt værktøj til genoverførsel til CNS; Produktionen af AAV er imidlertid en dyr og besværlig proces. Ved anvendelse af suspensionsceller reduceres arbejdskraft og plast sammenlignet med den klæbende kultur af HEK293T på 15 cm2 plader. Desuden er de koniske rør, der implementeres her, nemme at håndtere og maksimere brugen af laboratorieplads. Protokollen blev oprettet af to forskere og efterfølgende anvendt af andre i laboratoriet. En række produktioner af tre uafhængige forskere gav i gennemsnit nok vektorer pr. batch til at injicere 6-7 mus.
Anvendelsen af HEK293 suspensionsceller er beskrevet tidligere13,14. Den beskrevne suspensionscellelinje er imidlertid ikke frit tilgængelig til forskningsformål. Dette er en flaskehals for akademiske forskere, når de anvender de beskrevne metoder. Den suspensionscellelinje, der er beskrevet i denne protokol, er frit tilgængelig til forskningsformål. Kulturen af suspensionsceller blev udført i koniske rør i stedet for Erlenmeyers for at spare plads og tid. Med Erlenmeyers kan op til 4 produktioner dyrkes samtidigt, versus 12 produktioner ved hjælp af koniske rør. Koniske rør kan overføres direkte til centrifugen til høst.
En alternativ mulighed for et suspensionscellekultursystem er det baculovirale system. En fordel ved baculo-systemet er, at disse celler og medier er offentligt tilgængelige og let kan anvendes. For akademikere er arkiver som Addgene tilgængelige, der indeholder et stort bibliotek med brugsklare AAV-overførselsplasmider12. Selvom disse også kan have forbehold, såsom defekte ITR'er, tjener de som en god kilde til plug-and-play-eksperimenter. Valget blev truffet for at beholde et HEK293-baseret produktionssystem, da tilgængelige plasmider direkte kan bruges til produktion uden overførsel af konstruktionen til baculovirus.
Til transfektion er polyethyleneimin relativt billig og er derfor det valgte transfektionsreagens. Som et alternativ blev en ny transfektionsmetode (TransIt) evalueret for at øge udbyttet af vektorer. En tredobbelt forbedring blev observeret ved anvendelse af halvdelen af mængden plasmider. Dette gør TransIt til et interessant alternativt transfektionsreagens, når der er behov for større lagre. En begrænsning af dette er omkostningerne, hvilket gør det mindre interessant for små partier.
Sammenfattende præsenteres her en protokol, der kan bruges til at producere AAV med højt udbytte i suspensionsceller i en akademisk laboratorieindstilling. Der beskrives værktøjer, der kan bruges i en akademisk laboratorieindstilling til at producere AAV med et højt udbytte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En gratis prøve af TransIT blev leveret af Mirus til indledende test, hvorefter reagenset blev købt til videre brug. Forfatterne har ingen andre konkurrerende økonomiske interesser at rapportere.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) forskningsfond og et tilskud fra Start2Cure (0-TI-01). Vi takker Leisha Kopp for hendes input og råd i opsætningen af protokollen. Figurer blev oprettet ved hjælp af Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep - Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
