Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.
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Articolo metodologico
Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio delle interazioni tra diverse molecole è un aspetto cruciale per comprendere la patogenesi della malattia e lo screening dei bersagli farmacologici. L'umbelliferone, un ingrediente attivo della medicina tibetana Vicatia thibetica, mostra un effetto immunomodulatore con un meccanismo sconosciuto. La proteina CD40 è un bersaglio chiave nella risposta immunitaria. Pertanto, questo studio utilizza il principio della tecnologia di fluorescenza a scansione differenziale per analizzare le interazioni tra la proteina CD40 e l'umbelliferone utilizzando marcatori enzimatici fluorescenti. Inizialmente, la stabilità del colorante fluorescente arancione proteico è stata verificata sperimentalmente ed è stato determinato il rapporto di diluizione ottimale di 1:500. Successivamente, è stato osservato che il valore di fusione della temperatura (Tm) della proteina CD40 tendeva a diminuire con l'aumentare della concentrazione. È interessante notare che l'interazione tra la proteina CD40 e l'umbelliferone migliora la stabilità termica della proteina CD40. Questo studio rappresenta il primo tentativo di rilevare il potenziale di legame di composti e proteine di piccole molecole utilizzando micropiastre a fluorescenza e coloranti fluorescenti. La tecnica è caratterizzata da un'elevata sensibilità e accuratezza, promettenti progressi nei campi della stabilità delle proteine, della struttura delle proteine e delle interazioni proteina-ligando, facilitando così ulteriori ricerche ed esplorazioni.
Introduzione
La Vicatia thibetica H. Boissieu, pianta della famiglia delle ombrellifere, è comunemente usata nella medicina tibetana e rappresenta uno dei componenti essenziali dei cinque ingredienti di base (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., e Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Distribuita principalmente nel sud-ovest della Cina, come lo Yunnan nord-occidentale, il Sichuan occidentale, il Tibet e altre aree, la sua radice essiccata funge da sostituto locale dell'Angelica1. ....
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Protocollo
La soluzione composta, la soluzione proteica e il colorante sono stati introdotti in una soluzione PBS. Successivamente, i campioni sono stati sottoposti a riscaldamento graduale utilizzando un bagno secco di riscaldamento digitale e la stabilità termica delle proteine è stata valutata misurando la variazione dell'intensità della fluorescenza all'interno del sistema complesso. I passaggi dettagliati sono descritti di seguito e la Figura 1 illustra una panoramica del protocollo.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare una soluzione di umbelliferone da 1 mM aggiungendo 0,1 mg di umbel....
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Risultati
Il colorante arancione ha costantemente mostrato un'eccitazione stabile della fluorescenza a Ex = 470 nm e Em = 570 nm, sia a temperatura ambiente che a temperature elevate. È stato determinato un rapporto di diluizione ottimale di 1:500 (Figura 2A, B). Il rilevamento del valore di Tm si è rivelato difficile quando la concentrazione della proteina CD40 era inferiore a 15 μg/mL (Figura 3A, B). Tuttavia, a una concentrazione di 1.......
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Discussione
Il DSF, noto anche come saggio di spostamento termico o saggio di fluorescenza termica, è una tecnica impiegata per rilevare il processo di denaturazione termica delle proteine nei campioni monitorando le variazioni del segnale di fluorescenza del campione di prova o del colorante durante un lento aumento programmato della temperatura. Inizialmente istituito da Pantoliano14, il DSF funge da metodo ad alto rendimento. La procedura principale prevede l'aumento della temperatura su una piastra riscal.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Esprimiamo il nostro sincero apprezzamento per il sostegno finanziario ricevuto dal Progetto di Costruzione di Connotazione del 14° Piano Quinquennale dell'Università di Medicina Tibetana (2022ZYYGH12), dalle Materie Aperte 2022 del Laboratorio Chiave di Medicina Tibetana e Istruzione di Base del Ministero dell'Istruzione presso l'Università di Medicina Tibetana (ZYYJC-22-04), dal Programma Chiave di Ricerca e Sviluppo di Ningxia (2023BEG02012), e lo Xinglin Scholar Research Promotion Project dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (XKTD2022013).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Proteina CD40 | MedChemExpress | HY-P75408 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Lettore di micropiastre multifunzione FlexStation 3 | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | Software FlexStation 3 | |
| OriginPro 8 | OriginLab Corporation | v8.0724 (B724) | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato ( 1x) | Gibco | 8120485 | |
| SoftMax Pro 7.1 | Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD | SoftMax Pro 7.1 | |
| SSYPRO colorante arancione | Sigma | S5942 | |
| Umbelliferone | Shanghai Yuanye Biotechnology Co. | B21854 |
Riferimenti
- Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).
- Li, L., et al. Effects of Xigui extract on immunosup....
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Ristampe e permessi
