Tredimensionel cellekultur af fedtafledte stamceller i en hydrogel med fotobiomodulationsforstærkning

Summary

Her præsenterer vi en protokol, der demonstrerer brugen af hydrogel som en tredimensionel (3D) cellekulturramme for fedtafledt stamcellekultur (ADSC) og introducerer fotobiomodulation (PBM) for at forbedre spredningen af ADSC’er inden for 3D-kulturindstillingen.

Abstract

Fedtafledte stamceller (ADSC’er), der besidder multipotente mesenkymale egenskaber, der ligner stamceller, anvendes ofte i regenerativ medicin på grund af deres kapacitet til en bred vifte af celledifferentiering og deres evne til at forbedre migration, proliferation og afbøde inflammation. Imidlertid står ADSC’er ofte over for udfordringer med overlevelse og indkapsling i sår, primært på grund af ugunstige inflammatoriske tilstande. For at løse dette problem er hydrogeler blevet udviklet til at opretholde ADSC-levedygtighed i sår og fremskynde sårhelingsprocessen. Her havde vi til formål at vurdere den synergistiske virkning af fotobiomodulation (PBM) på ADSC-proliferation og cytotoksicitet inden for en 3D-cellekulturramme. Udødeliggjorte ADSC’er blev podet i 10 μL hydrogeler med en densitet på 2,5 x 10³ celler og udsat for bestråling ved hjælp af 525 nm og 825 nm dioder ved fluenser på 5 J / cm² og 10 J / cm². Morfologiske ændringer, cytotoksicitet og proliferation blev evalueret ved 24 timer og 10 dage efter PBM-eksponering. ADSC’erne udviste en afrundet morfologi og blev spredt gennem gelen som individuelle celler eller sfæroidaggregater. Det er vigtigt, at både PBM- og 3D-kulturrammen ikke viste cytotoksiske virkninger på cellerne, mens PBM signifikant forbedrede spredningshastighederne for ADSC’er. Afslutningsvis demonstrerer denne undersøgelse brugen af hydrogel som et passende 3D-miljø til ADSC-kultur og introducerer PBM som en betydelig forstærkningsstrategi, især adressering af de langsomme spredningshastigheder forbundet med 3D-cellekultur.

Introduction

ADSC’er er mesenkymale multipotente stamceller med kapacitet til selvfornyelse og differentiering i flere cellelinjer. Disse celler kan høstes fra den stromale vaskulære fraktion (SVF) af fedtvæv under en lipoaspirationsprocedure¹. ADSC’er er opstået som en ideel stamcelletype til brug i regenerativ medicin, fordi disse celler er rigelige, minimalt invasive at høste, let tilgængelige og velkarakteriserede². Stamcelleterapi tilbyder en mulig vej til sårheling ved at stimulere cellemigration, proliferation, neovaskularisering og reducere inflammation i sår ^3,4. Omkring 80% af ADSC’ernes regenerative kapacitet kan tilskrives parakrin signalering via deres sekretom⁵. Tidligere blev det foreslået, at en direkte lokal injektion af stamceller eller vækstfaktorer i beskadiget væv kunne ulovliggøre tilstrækkelige in vivo-reparationsmekanismer ^6,7,8. Denne tilgang stod imidlertid over for flere udfordringer, såsom dårlig overlevelse og reduceret stamcelleindkapsling i beskadiget væv som følge af det inflammatoriske miljø ⁹. Desuden var en af de nævnte grunde manglen på en ekstracellulær matrix til at understøtte overlevelsen og funktionaliteten af de transplanterede celler¹⁰. For at overvinde disse udfordringer lægges der nu vægt på udvikling af biomaterialebærere til støtte for stamcellers levedygtighed og funktion.

Tredimensionel (3D) cellekultur forbedrer celle-til-celle og celle-til-matrix interaktion in vitro for at give et miljø, der bedre ligner in vivo-miljøet ¹¹. Hydrogeler er blevet grundigt undersøgt som en klasse af biomaterialebærere, der giver et 3D-miljø til stamcellekultur. Disse strukturer er lavet af vand og tværbundne polymerer¹². Indkapsling af ADSC’er i hydrogel har næsten ingen cytotoksisk virkning på cellerne under dyrkning, samtidig med at cellernes levedygtighed^{opretholdes 6}. Stamceller dyrket i 3D demonstrerer øget fastholdelse af deres stamme og forbedret differentieringskapacitet¹³. Tilsvarende viste hydrogelfrøede ADSC’er øget levedygtighed og accelereret sårlukning i dyremodeller¹⁴. Desuden øger hydrogelindkapsling signifikant indkapsling og tilbageholdelse af ADSC’er i sår^15,16. TrueGel3D er lavet af en polymer, enten polyvinylalkohol eller dextran, størknet af en tværbinding, enten cyclodextrin eller polyethylenglycol¹⁷. Gelen er en syntetisk hydrogel, der ikke indeholder animalske produkter, der kan forstyrre forsøgene eller udløse en immunreaktion under transplantationen af gelen til en patient, mens den effektivt efterligner en ekstracellulær matrix¹⁸. Gelen kan tilpasses fuldt ud ved at ændre sammensætningen og de enkelte komponenter. Det kan rumme forskellige stamceller og understøtte differentieringen af flere celletyper ved at justere stivheden af gelen¹⁹. Vedhæftningssteder kan oprettes ved tilsætning af peptider²⁰. Gelen er nedbrydelig ved udskillelse af metalloproteases, hvilket muliggør cellemigration²¹. Endelig er det klart og giver mulighed for billeddannelsesteknikker.

PBM er en minimalt invasiv og let udført form for laserterapi på lavt niveau, der bruges til at stimulere intracellulære kromoforer. Forskellige bølgelængder fremkalder forskellige virkninger på celler²². Lys i det røde til nær-infrarøde område stimulerer øget adenosintrifosfat (ATP) og produktion af reaktive iltarter (ROS) ved at øge flux gennem elektrontransportkæden²³. Lys i de blå og grønne områder stimulerer lyslukkede ionkanaler, hvilket muliggør den ikke-specifikke tilstrømning af kationer, såsom calcium og magnesium, til celler, hvilket vides at forbedre differentiering²⁴. Nettoeffekten er genereringen af sekundære budbringere, der stimulerer transkriptionen af faktorer, der udløser nedstrøms cellulære processer såsom migration, spredning og differentiering²⁵. PBM kan anvendes til at prækonditionere celler til at formere sig eller differentiere, før cellerne transplanteres i et ugunstigt miljø, f.eks. beskadiget væv²⁶. Før og efter transplantation PBM (630 nm og 810 nm) eksponering af ADSC’er forbedrede signifikant levedygtigheden og funktionen af disse celler in vivo i en diabetisk rottemodel²⁷. Regenerativ medicin kræver et tilstrækkeligt antal celler til effektiv reparation af væv²⁸. I 3D-cellekultur har ADSC’er været forbundet med langsommere spredningshastigheder sammenlignet med todimensionel cellekultur⁶. PBM kan dog bruges til at øge 3D-cellekulturprocessen i ADSC’er ved at forbedre levedygtighed, spredning, migration og differentiering^29,30.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og software, der anvendes i denne protokol. Protokollen er grafisk opsummeret i figur 1. 1. Todimensionel (2D) cellekultur BEMÆRK: Udødeliggjorte ADSC’er (1 x106 celler) opbevares ved -195,8 °C i flydende nitrogen i et kryopræserveringshætteglas, der indeholder 1 ml cellefrysemedier. Klargøring a…

Representative Results

For at vurdere morfologien og visuelt inspicere hydrogelernes celletæthed blev invers mikroskopi anvendt (figur 2). ADSC’erne bevarede en afrundet morfologi 24 timer efter såning og PBM-eksponering. Cellerne blev spredt gennem gelen som enkeltceller eller i druelignende klynger. Morfologien var uændret efter 10 dage i 3D-kultur. Der blev ikke konstateret nogen definitiv forskel i morfologi mellem forsøgsgrupperne og kontrollerne eller mellem de forskellige eksperimentelle grupper. <p…

Discussion

ADSC’er er en ideel celletype til brug for regenerativ medicin, da de stimulerer forskellige processer til at hjælpe med sårheling ^3,4. Der er dog flere udfordringer, der skal omgås, f.eks. dårlige overlevelsesrater og ineffektiv indkapsling af cellerne på et skadested⁹. Udødeliggjorte celler blev brugt som en kommercielt tilgængelig cellelinje, da de kan passeres i flere generationer sammenlignet med primære celler, de behøver ik…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader