Hidrojel İçinde Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin Fotobiyomodülasyon Ogmentasyonu ile Üç Boyutlu Hücre Kültürü
Summary
Burada, adipoz kaynaklı kök hücre (ADSC) kültürü için üç boyutlu (3D) hücre kültürü çerçevesi olarak hidrojelin kullanımını gösteren ve 3D kültür ortamında ADSC’lerin proliferasyonunu arttırmak için fotobiyomodülasyonu (PBM) tanıtan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kök hücrelere benzer multipotent mezenkimal özelliklere sahip olan yağ kaynaklı kök hücreler (ADSC’ler), çok çeşitli hücre farklılaşması kapasiteleri ve göçü, proliferasyonu artırma ve iltihabı hafifletme yetenekleri nedeniyle rejeneratif tıpta sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ADSC’ler, öncelikle elverişsiz enflamatuar koşullar nedeniyle, yaralarda sağkalım ve aşılamada sıklıkla zorluklarla karşılaşırlar. Bu sorunu çözmek için, yaralarda ADSC canlılığını sürdürmek ve yara iyileşme sürecini hızlandırmak için hidrojeller geliştirilmiştir. Burada, fotobiyomodülasyonun (PBM) ADSC proliferasyonu ve sitotoksisite üzerindeki sinerjik etkisini 3 boyutlu hücre kültürü çerçevesinde değerlendirmeyi amaçladık. Ölümsüzleştirilmiş ADSC’ler, 2.5 x 103 hücre yoğunluğunda 10 μL hidrojellere ekildi ve 5 J /cm2 ve 10 J /cm2 akıcılıklarında 525 nm ve 825 nm diyotlar kullanılarak ışınlamaya tabi tutuldu. Morfolojik değişiklikler, sitotoksisite ve proliferasyon, PBM maruziyetinden 24 saat ve 10 gün sonra değerlendirildi. ADSC’ler yuvarlak bir morfoloji sergiledi ve jel boyunca tek tek hücreler veya sferoid agregalar olarak dağıldı. Daha da önemlisi, hem PBM hem de 3D kültür çerçevesi hücreler üzerinde sitotoksik etki göstermezken, PBM ADSC’lerin proliferasyon oranlarını önemli ölçüde arttırdı. Sonuç olarak, bu çalışma, hidrojelin ADSC kültürü için uygun bir 3D ortam olarak kullanımını göstermekte ve PBM’yi, özellikle 3D hücre kültürü ile ilişkili yavaş proliferasyon oranlarını ele alan önemli bir büyütme stratejisi olarak tanıtmaktadır.
Introduction
ADSC’ler, kendi kendini yenileme ve çeşitli hücre soylarına farklılaşma kapasitesine sahip mezenkimal multipotent progenitör hücrelerdir. Bu hücreler, bir lipoaspirasyon prosedürü sırasında yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan (SVF) alınabilir1. ADSC’ler, rejeneratif tıpta kullanmak için ideal bir kök hücre tipi olarak ortaya çıkmıştır, çünkü bu hücreler bol miktarda bulunur, hasat için minimal invazivdir, kolay erişilebilir ve iyi karakterize edilmiştir2. Kök hücre tedavisi, hücre göçünü, proliferasyonu, neovaskülarizasyonu uyararak ve yaralardaki iltihabı azaltarak yara iyileşmesi için olası bir yol sunar 3,4. ADSC’lerin rejeneratif kapasitesinin kabaca %80’i, sekretomları5 aracılığıyla parakrin sinyalizasyonuna atfedilebilir. Daha önce, kök hücrelerin veya büyüme faktörlerinin hasarlı dokuya doğrudan lokal enjeksiyonunun in vivo onarım mekanizmalarını yeterince yasadışı hale getirebileceği öne sürülmüştür 6,7,8. Bununla birlikte, bu yaklaşım, enflamatuar ortamın bir sonucu olarak hasarlı dokularda zayıf sağkalım ve azalmış kök hücre aşılaması gibi çeşitli zorluklarla karşı karşıya kalmıştır 9. Ayrıca, belirtilen nedenlerden biri, nakledilen hücrelerin hayatta kalmasını ve işlevselliğini desteklemek için hücre dışı bir matrisin olmamasıydı10. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, kök hücre canlılığını ve işlevini desteklemek için biyomateryal taşıyıcıların geliştirilmesine önem verilmektedir.
Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, in vivo ortama daha iyi benzeyen bir ortam sağlamak için in vitro olarak hücreden hücreye ve hücreden matrise etkileşimi geliştirir11. Hidrojeller, kök hücre kültürü için 3 boyutlu bir ortam sağlayan bir biyomateryal taşıyıcı sınıfı olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu yapılar su ve çapraz bağlı polimerlerdenyapılmıştır 12. ADSC’lerin hidrojel içinde kapsüllenmesi, hücrelerin canlılığını korurken kültür sırasında hücreler üzerinde neredeyse hiç sitotoksik etkiye sahip değildir6. 3D olarak kültürlenen kök hücreler, saplarının daha iyi tutulduğunu ve farklılaşma kapasitesinin arttığını gösterir13. Benzer şekilde, hidrojel tohumlu ADSC’ler, hayvan modellerinde artan canlılık ve hızlandırılmış yara kapanması göstermiştir14. Ayrıca, hidrojel kapsülleme, yaralarda ADSC’lerin aşılanmasını ve tutulmasını önemli ölçüde artırır15,16. TrueGel3D, siklodekstrin veya polietilen glikol17 gibi bir çapraz bağlayıcı ile katılaştırılmış, polivinil alkol veya dekstran polimerden yapılmıştır. Jel, hücre dışı bir matrisi etkili bir şekilde taklit ederken, jelin bir hastaya nakli sırasında deneylere müdahale edebilecek veya bir bağışıklık reaksiyonunu tetikleyebilecek herhangi bir hayvansal ürün içermeyen sentetik bir hidrojeldir18. Jel, bileşimi ve tek tek bileşenleri değiştirerek tamamen özelleştirilebilir. Farklı kök hücreleri barındırabilir ve jelin sertliğini ayarlayarak çeşitli hücre tiplerinin farklılaşmasını destekleyebilir19. Bağlanma bölgeleri, peptitlerin20 eklenmesiyle oluşturulabilir. Jel, metaloproteazların salgılanmasıyla parçalanabilir ve hücre göçüneizin verir 21. Son olarak, açıktır ve görüntüleme tekniklerine izin verir.
PBM, hücre içi kromoforları uyarmak için kullanılan minimal invaziv ve kolayca gerçekleştirilen düşük seviyeli bir lazer tedavisi şeklidir. Farklı dalga boyları hücreler üzerinde farklı etkiler ortaya çıkarır22. Kırmızı ila yakın kızılötesi aralığındaki ışık, elektron taşıma zinciri23 boyunca akıyı artırarak artan adenozin trifosfat (ATP) ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini uyarır. Mavi ve yeşil aralıklardaki ışık, ışık kapılı iyon kanallarını uyararak, kalsiyum ve magnezyum gibi katyonların hücrelere spesifik olmayan akışına izin verir, bu da farklılaşmayı arttırdığı bilinmektedir24. Net etki, göç, proliferasyon ve farklılaşma gibi aşağı akış hücresel süreçleri tetikleyen faktörlerin transkripsiyonunu uyaran ikincil habercilerin üretilmesidir25. PBM, hücreleri olumsuz bir ortama, örneğin hasarlı dokuya nakletmeden önce hücrelerin çoğalmasını veya farklılaşmasını sağlamak için ön koşullandırmak için kullanılabilir26. ADSC’lerin nakil öncesi ve sonrası PBM (630 nm ve 810 nm) maruziyeti, diyabetik sıçan modelinde in vivo olarak bu hücrelerin canlılığını ve işlevini önemli ölçüde arttırdı27. Rejeneratif tıp, dokuların etkili bir şekilde onarılması için yeterli sayıda hücre gerektirir28. 3D hücre kültüründe, ADSC’ler, iki boyutlu hücre kültürüne kıyasla daha yavaş proliferasyon oranları ile ilişkilendirilmiştir6. Bununla birlikte, PBM, canlılığı, proliferasyonu, göçü ve farklılaşmayı artırarak ADSC’lerin 3D hücre kültürü sürecini artırmak için kullanılabilir29,30.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADSC’ler, yara iyileşmesine yardımcı olmak için çeşitli süreçleri uyardıkları için rejeneratif tıp için ideal bir hücre tipidir 3,4. Bununla birlikte, aşılması gereken birkaç zorluk vardır, örneğin, zayıf hayatta kalma oranları ve bir yaralanma bölgesindeki hücrelerin etkisiz aşılanması9. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, birincil hücrelere kıyasla daha fazla nesil boyunca geçebildikleri, hasat edilmeleri ge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı Thuthuka Instrument, hibe numarası TTK2205035996 tarafından finanse edilmiştir; Bilim ve Yenilik Departmanı (DSI) tarafından finanse edilen Afrika Lazer Merkezi (ALC), ALC-R007 görevi HLHA23X hibe numarası; Üniversite Araştırma Konseyi, hibe numarası 2022URC00513; Bilim ve Teknoloji Bakanlığı’nın Güney Afrika Araştırma Sandalyeleri Girişimi (DST-NRF/SARChI), hibe numarası 98337. Finansman kuruluşları, çalışmanın tasarımında, toplanmasında, analizinde, verilerin yorumlanmasında veya makalenin yazılmasında hiçbir rol oynamamıştır. Yazarlar, Johannesburg Üniversitesi’ne (UJ) ve Lazer Araştırma Merkezi’ne (LRC) tesisleri ve kaynakları kullandıkları için teşekkür eder.
Materials
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher – Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
Riferimenti
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -. C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024)
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -. Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. . Guide to Research Techniques in Neuroscience. , (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
