Driedimensionale celkweek van van vet afgeleide stamcellen in een hydrogel met fotobiomodulatie-augmentatie
Summary
Hier presenteren we een protocol dat het gebruik van hydrogel demonstreert als een driedimensionaal (3D) celkweekraamwerk voor vet-afgeleide stamcelkweek (ADSC) en de introductie van fotobiomodulatie (PBM) om de proliferatie van ADSC’s binnen de 3D-kweekomgeving te verbeteren.
Abstract
Van vet afgeleide stamcellen (ADSC’s), met multipotente mesenchymale kenmerken die verwant zijn aan stamcellen, worden vaak gebruikt in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun vermogen tot een breed scala aan celdifferentiatie en hun vermogen om migratie, proliferatie te verbeteren en ontstekingen te verminderen. ADSC’s worden echter vaak geconfronteerd met uitdagingen bij overleving en implantatie in wonden, voornamelijk als gevolg van ongunstige ontstekingsomstandigheden. Om dit probleem aan te pakken, zijn hydrogels ontwikkeld om de levensvatbaarheid van ADSC in wonden te behouden en het wondgenezingsproces te versnellen. Hier wilden we de synergetische impact van fotobiomodulatie (PBM) op ADSC-proliferatie en cytotoxiciteit beoordelen binnen een 3D-celkweekkader. Onsterfelijke ADSC’s werden gezaaid in hydrogels van 10 μl met een dichtheid van 2,5 x 103 cellen en onderworpen aan bestraling met diodes van 525 nm en 825 nm met fluenties van 5 J/cm2 en 10 J/cm2. Morfologische veranderingen, cytotoxiciteit en proliferatie werden 24 uur en 10 dagen na PBM-blootstelling geëvalueerd. De ADSC’s vertoonden een afgeronde morfologie en waren verspreid door de gel als individuele cellen of sferoïde aggregaten. Belangrijk is dat zowel PBM als het 3D-kweekraamwerk geen cytotoxische effecten op de cellen vertoonden, terwijl PBM de proliferatiesnelheden van ADSC’s aanzienlijk verhoogde. Concluderend toont deze studie het gebruik van hydrogel aan als een geschikte 3D-omgeving voor ADSC-kweek en introduceert PBM als een belangrijke augmentatiestrategie, met name gericht op de langzame proliferatiesnelheden die gepaard gaan met 3D-celkweek.
Introduction
ADSC’s zijn mesenchymale multipotente voorlopercellen met het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in verschillende cellijnen. Deze cellen kunnen tijdens een lipoaspiratieprocedureworden geoogst uit de stromale vasculaire fractie (SVF) van vetweefsel1. ADSC’s zijn naar voren gekomen als een ideaal stamceltype om te gebruiken in de regeneratieve geneeskunde, omdat deze cellen overvloedig zijn, minimaal invasief om te oogsten, gemakkelijk toegankelijk engoed gekarakteriseerd. Stamceltherapie biedt een mogelijke weg voor wondgenezing door celmigratie, proliferatie, neovascularisatie te stimuleren en ontstekingen in wonden te verminderen 3,4. Ongeveer 80% van het regeneratieve vermogen van ADSC’s is toe te schrijven aan paracriene signalering via hun secretoom5. Eerder werd gesuggereerd dat een directe lokale injectie van stamcellen of groeifactoren in beschadigd weefsel voldoende in vivo herstelmechanismen zou kunnen veroorzaken 6,7,8. Deze aanpak stuitte echter op verschillende uitdagingen, zoals een slechte overleving en verminderde stamcelimplantatie in beschadigde weefsels als gevolg van de inflammatoire omgeving. Bovendien was een van de genoemde redenen het ontbreken van een extracellulaire matrix om de overleving en functionaliteit van de getransplanteerde cellen te ondersteunen10. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, wordt nu de nadruk gelegd op de ontwikkeling van biomateriaaldragers om de levensvatbaarheid en functie van stamcellen te ondersteunen.
Driedimensionale (3D) celkweek verbetert de interactie tussen cellen en cellen en matrixen in vitro om een omgeving te bieden die beter lijkt op de in vivo omgeving11. Hydrogels zijn uitgebreid bestudeerd als een klasse van biomateriaaldragers die een 3D-omgeving bieden voor stamcelkweek. Deze structuren zijn gemaakt van water en verknoopte polymeren12. Inkapseling van ADSC’s in hydrogel heeft vrijwel geen cytotoxisch effect op de cellen tijdens de kweek, terwijl de levensvatbaarheid van de cellen behoudenblijft 6. Stamcellen die in 3D zijn gekweekt, vertonen een verbeterd behoud van hun stamheid en een verbeterd differentiatievermogen13. Evenzo vertoonden ADSC’s met hydrogel gezaaide ADSC’s een verhoogde levensvatbaarheid en versnelde wondsluiting in diermodellen14. Bovendien verhoogt hydrogel-inkapseling de implantatie en retentie van ADSC’s in wonden aanzienlijk15,16. TrueGel3D is gemaakt van een polymeer, polyvinylalcohol of dextran, gestold door een crosslinker, cyclodextrine of polyethyleenglycol17. De gel is een synthetische hydrogel die geen dierlijke producten bevat die de experimenten kunnen verstoren of een immuunreactie kunnen veroorzaken tijdens de transplantatie van de gel in een patiënt, terwijl een extracellulaire matrix effectief wordt nagebootst18. De gel is volledig aanpasbaar door de samenstelling en afzonderlijke componenten te wijzigen. Het kan verschillende stamcellen huisvesten en de differentiatie van verschillende celtypen ondersteunen door de stijfheid van de gel aan te passen19. Aanhechtingsplaatsen kunnen worden gecreëerd door de toevoeging van peptiden20. De gel is afbreekbaar door de afscheiding van metalloproteasen, waardoor celmigratie mogelijkis21. Ten slotte is het duidelijk en maakt het beeldvormingstechnieken mogelijk.
PBM is een minimaal invasieve en gemakkelijk uit te voeren vorm van lasertherapie op laag niveau die wordt gebruikt om intracellulaire chromoforen te stimuleren. Verschillende golflengten wekken verschillende effecten op cellen op22. Licht in het rode tot nabij-infrarode bereik stimuleert een verhoogde productie van adenosinetrifosfaat (ATP) en reactieve zuurstofsoorten (ROS) door de flux door de elektronentransportketen te verbeteren23. Licht in het blauwe en groene bereik stimuleert lichtafhankelijke ionkanalen, waardoor de niet-specifieke instroom van kationen, zoals calcium en magnesium, in cellen mogelijk wordt, waarvan bekend is dat het de differentiatie verbetert24. Het netto-effect is de generatie van secundaire boodschappers die de transcriptie stimuleren van factoren die stroomafwaartse cellulaire processen in gang zetten, zoals migratie, proliferatie en differentiatie25. PBM kan worden gebruikt om cellen vooraf te conditioneren om zich te vermenigvuldigen of te differentiëren voordat de cellen worden getransplanteerd in een ongunstige omgeving, bijvoorbeeld beschadigdweefsel26. Blootstelling aan PBM (630 nm en 810 nm) van ADSC’s vóór en na transplantatie verbeterde de levensvatbaarheid en functie van deze cellen in vivo aanzienlijk in een diabetisch rattenmodel27. Regeneratieve geneeskunde vereist een voldoende aantal cellen voor effectief herstel van weefsels28. In 3D-celkweek zijn ADSC’s in verband gebracht met langzamere proliferatiesnelheden in vergelijking met tweedimensionale celkweek6. PBM kan echter worden gebruikt om het 3D-celkweekproces van ADSC’s te verbeteren door de levensvatbaarheid, proliferatie, migratie en differentiatie te verbeteren29,30.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADSC’s zijn een ideaal celtype om te gebruiken voor regeneratieve geneeskunde, omdat ze verschillende processen stimuleren om te helpen bij wondgenezing 3,4. Er zijn echter verschillende uitdagingen die moeten worden omzeild, bijvoorbeeld slechte overlevingskansen en ineffectieve implantatie van de cellen op eenverwondingsplaats9. Onsterfelijke cellen werden gebruikt als een in de handel verkrijgbare cellijn, omdat ze meer generaties kunne…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, subsidienummer TTK2205035996; het Department of Science and Innovation (DSI) financierde African Laser Centre (ALC), subsidienummer HLHA23X taak ALC-R007; de Universitaire Onderzoeksraad, subsidienummer 2022URC00513; het South African Research Chairs Initiative van het Department of Science and Technology (DST-NRF/SARChI), subsidienummer 98337. De financiers speelden geen rol bij het ontwerp van het onderzoek, het verzamelen, analyseren, interpreteren van de gegevens of het schrijven van het manuscript. De auteurs bedanken de Universiteit van Johannesburg (UJ) en het Laser Research Centre (LRC) voor hun gebruik van de faciliteiten en middelen.
Materials
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher – Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
Riferimenti
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -. C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024)
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -. Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. . Guide to Research Techniques in Neuroscience. , (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
