Konstruktion af metaboliske netværk uden for ligevægt i vesikler i nano- og mikrometerstørrelse
Summary
Vi præsenterer en protokol til rekonstituering af membranproteiner og indkapsling af enzymer og andre vandopløselige komponenter i lipidvesikler af submikrometer- og mikrometerstørrelse.
Abstract
Vi præsenterer en metode til at inkorporere komplekse proteinnetværk i vesikler, der involverer integrerede membranproteiner, enzymer og fluorescensbaserede sensorer, ved hjælp af oprensede komponenter. Denne metode er relevant for design og konstruktion af bioreaktorer og studiet af komplekse metaboliske reaktionsnetværk uden for ligevægt. Vi starter med at rekonstituere (flere) membranproteiner til store unilamellære vesikler (LUV’er) i henhold til en tidligere udviklet protokol. Vi indkapsler derefter en blanding af oprensede enzymer, metabolitter og fluorescensbaserede sensorer (fluorescerende proteiner eller farvestoffer) via fryse-tø-ekstrudering og fjerne ikke-inkorporerede komponenter ved centrifugering og/eller størrelsesudelukkelseskromatografi. Ydeevnen af de metaboliske netværk måles i realtid ved at overvåge ATP/ADP-forholdet, metabolitkoncentrationen, intern pH eller andre parametre ved fluorescensudlæsning. Vores membranproteinholdige vesikler med en diameter på 100-400 nm kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV’er) ved hjælp af eksisterende, men optimerede procedurer. Tilgangen muliggør inkludering af opløselige komponenter (enzymer, metabolitter, sensorer) i mikrometerstore vesikler og dermed opskalere volumenet af bioreaktorerne med størrelsesordener. Det metaboliske netværk, der indeholder GUV’er, er fanget i mikrofluidiske enheder til analyse ved optisk mikroskopi.
Introduction
Området for bottom-up syntetisk biologi fokuserer på konstruktion af (minimale) celler 1,2 og metaboliske bioreaktorer til bioteknologiske 3,4 eller biomedicinske formål 5,6,7,8. Konstruktionen af syntetiske celler giver en unik platform, der giver forskere mulighed for at studere (membran) proteiner under veldefinerede forhold, der efterligner dem i native miljøer, hvilket muliggør opdagelsen af emergente egenskaber og skjulte biokemiske funktioner af proteiner og reaktionsnetværk9. Som et mellemliggende skridt mod en autonomt fungerende syntetisk celle udvikles moduler, der fanger væsentlige træk ved levende celler såsom metabolisk energibevarelse, protein- og lipidsyntese og homeostase. Sådanne moduler forbedrer ikke kun vores forståelse af livet, men har også potentielle anvendelser inden for medicin8 og bioteknologi10.
Transmembranproteiner er kernen i stort set ethvert metabolisk netværk, da de transporterer molekyler ind eller ud af cellen, signalerer og reagerer på miljøets kvalitet og spiller adskillige biosyntetiske roller. Således kræver konstruktionen af metaboliske moduler i syntetiske celler i de fleste tilfælde rekonstituering af integrerede og/eller perifere membranproteiner til et membrandobbeltlag sammensat af specifikke lipider og høj integritet (lav permeabilitet). Håndteringen af disse membranproteiner er udfordrende og kræver specifik viden og eksperimentelle færdigheder.
Der er udviklet flere metoder til at rekonstituere membranproteiner i fosfolipidvesikler, oftest med det formål at studere funktionen11,12, regulering13, kinetiske egenskaber14,15, lipidafhængighed15,16 og/eller stabilitet17 af et specifikt protein. Disse metoder omfatter hurtig fortynding af vaskemiddelopløseligt protein til vandige medier i nærvær af lipider18, fjernelse af vaske- og rengøringsmidler ved inkubation af vaskemiddelopløseligt protein med vaskemiddeldestabiliserede lipidvesikler og absorption af vaske- eller rengøringsmiddelet eller vaske- og rengøringsmidlerne på polystyrenperler19 eller fjernelse af vaske- og rengøringsmidler ved dialyse eller størrelsesudelukkelseskromatografi20. Organiske opløsningsmidler er blevet brugt til at danne lipidvesikler, for eksempel via dannelsen af olie-vand-interfaser21, men størstedelen af integrerede membranproteiner inaktiveres, når de udsættes for sådanne opløsningsmidler.
I vores laboratorium rekonstituerer vi for det meste membranproteiner ved hjælp af vaskemiddelabsorptionsmetoden for at danne store unilamellære vesikler (LUV’er)19. Denne metode tillader samrekonstituering af flere membranproteiner og indkapsling i vesikellumen af enzymer, metabolitter og prober22,23. De membranproteinholdige LUV’er kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV’er) med/uden indkapsling af vandopløselige komponenter ved hjælp af enten elektrodannelse24 eller gelassisteret hævelse25 og specifikke betingelser for at bevare membranproteinernes integritet26.
Denne artikel præsenterer en protokol til rekonstituering i LUV’er af et metabolisk netværk uden for ligevægt, der regenererer ATP gennem nedbrydning af L-arginin til L-ornitin27. Dannelsen af ATP er koblet til produktionen af glycerol-3-phosphat (G3P), en vigtig byggesten for fosfolipidsyntese22,28. Den metaboliske vej består af to integrerede membranproteiner, en arginin/ornitin (ArcD) og en G3P/Pi-antiporter (GlpT). Derudover kræves tre opløselige enzymer (ArcA, ArcB, ArcC) til genanvendelse af ATP, og GlpK bruges til at omdanne glycerol til glycerol 3-phosphat ved hjælp af ATP fra nedbrydningen af L-arginin, se figur 1 for en skematisk oversigt over vejen. Denne protokol repræsenterer et godt udgangspunkt for den fremtidige konstruktion af endnu mere komplekse reaktionsnetværk – til syntese af lipider eller proteiner eller deling af celler. Vesiklernes lipidsammensætning understøtter aktiviteten af en lang række integrerede membranproteiner og er optimeret til transport af forskellige molekyler ind i eller ud af vesiklerne 27,29,30.
Figur 1: Oversigt over vejen for ATP-produktion og glycerol-3-phosphatsyntese og -udskillelse, klik her for at se en større version af denne figur.
Kort sagt tilsættes rensede membranproteiner (opløst i dodecyl-β-D-maltosid, DDM) til præformede lipidvesikler, der er blevet destabiliseret med Triton X-100, hvilket tillader indsættelse af proteinerne i membranen. Vaskemiddelmolekylerne fjernes efterfølgende (langsomt) ved tilsætning af aktiverede polystyrenperler, hvilket resulterer i dannelsen af godt forseglede proteoliposomer. Opløselige komponenter kan derefter tilsættes vesiklerne og indkapsles via fryse-optøningscyklusser, som fanger molekylerne i membranfusionsprocessen. De opnåede vesikler er meget heterogene og mange er multilamellære. De ekstruderes derefter gennem et polycarbonatfilter med en porestørrelse på 400, 200 eller 100 nm, hvilket giver mere ensartede vesikler; Jo mindre porestørrelsen er, jo mere homogene og unilamellære er vesiklerne, men til prisen for et mindre indre volumen. Ikke-inkorporerede proteiner og små molekyler fjernes fra den eksterne opløsning ved størrelsesudelukkelseskromatografi. ProteoGUL’erne kan omdannes til vesikler i mikrometerstørrelse ved gelassisteret hævelse, og disse proteoGUL’er opsamles derefter og fanges i en mikrofluidisk chip til mikroskopisk karakterisering og manipulation. Figur 2 viser en skematisk oversigt over den fulde protokol.
Figur 2: Oversigt over protokollen for rekonstituering af membranproteiner og indkapsling af enzymer og vandopløselige komponenter i lipidvesikler af submikrometer (LV’er) og mikrometerstørrelse (GUV’er).
Rekonstitutions- og indkapslingsprotokollerne fungerer godt, og proteinernes funktionalitet bevares, men proteoGUL’erne og proteoGUV’erne er heterogene i størrelse. Mikrofluidiske tilgange 31,32 tillader dannelse af mikrometerstore vesikler, der er mere homogene i størrelse, men funktionel rekonstitution af membranproteiner er generelt ikke mulig, fordi resterende opløsningsmiddel i dobbeltlaget inaktiverer proteinerne. ProteoUV’erne varierer i størrelse fra 100 til 400 nm, og ved lave koncentrationer af enzymer kan indkapslingen føre til vesikler med ufuldstændige metaboliske veje (stokastiske effekter; se figur 3). LÚV’er er ideelle til at konstruere specifikke metaboliske moduler, som vist her til produktion af ATP og byggesten som G3P. Sådanne proteoGUL’er kan potentielt indkapsles i GUV’er og tjene som organellignende rum for værtsvesiklerne.
Figur 3: Antal molekyler pr. vesikel med en diameter på 100, 200 eller 400 nm. (A) Når de indkapslede proteiner (enzymer, prober) er i området 1-10 μM. (B) Rekonstitutionen sker ved 1 til 1.000, 1 til 10.000 og 1 til 100.000 membranproteiner pr. lipid (mol/mol). Vi antager, at molekyler er indkapslet i de angivne koncentrationer og inkorporeret i membranen ved disse protein-til-lipid-forhold. For nogle enzymer har vi set, at de binder sig til membraner, hvilket kan øge deres tilsyneladende koncentration i vesiklerne. Forkortelse: LPR = Lipid-Protein-Ratio Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer en protokol for syntese af (membran)protein, der indeholder lipidvesikler i submikrometerstørrelse (proteoGUL’er), og omdannelse af proteoLÚV’er til gigantiske unilamellære vesikler (proteoGUV’er). Protokollen bør gælde for rekonstitution af andre membranproteiner 13,19,30,40 og indkapsling af andre metaboliske netværk end L-arginin-nedbrydningen og glycerol-3-phosphatsyntesevejene, der er præsenteret her.…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Aditya Iyer for kloningen af pBAD-PercevalHR-genet og Gea Schuurman-Wolters for at hjælpe med proteinproduktion og oprensning. Forskningen blev finansieret af NWO Gravitation-programmet “Building a Synthetic Cell” (BaSyC).
Materials
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium | – | |
| D(+)-Sucrose | Formedium | – | |
| DDM | Glycon | D97002 -C | |
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
| Glycerol | BOOM | 51171608 | |
| Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
| Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| Light microscope | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
| Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
| Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
| Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
| Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
| Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
Riferimenti
- Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
- Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
- Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
- Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -. H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
- Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
- Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
- Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
- Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
- Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Ingegneria. 2 (2), 225-229 (2016).
- Schmidt, D., Jiang, Q. -. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
- Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
- Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
- Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
- Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
- Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
- Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
- Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
- Rigaud, J. -. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA – Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- . Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023)
- Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , 161-176 (2009).
- Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
- Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
- Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
- Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
- Van’T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
- Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
- Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
- Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
- Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
- Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
- Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
- Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
- Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
- Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
- Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
- Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).
