Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und anderen wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln von Submikrometer- und Mikrometergröße vor.

Abstract

Wir stellen eine Methode vor, um komplexe Proteinnetzwerke in Vesikel einzubauen, an denen integrale Membranproteine, Enzyme und fluoreszenzbasierte Sensoren unter Verwendung gereinigter Komponenten beteiligt sind. Diese Methode ist relevant für das Design und den Bau von Bioreaktoren und die Untersuchung komplexer metabolischer Reaktionsnetzwerke außerhalb des Gleichgewichts. Wir beginnen mit der Rekonstitution von (mehreren) Membranproteinen zu großen unilamellären Vesikeln (LUVs) nach einem zuvor entwickelten Protokoll. Anschließend verkapseln wir ein Gemisch aus gereinigten Enzymen, Metaboliten und fluoreszenzbasierten Sensoren (fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe) mittels Gefrier-Auftau-Extrusion und entfernen nicht eingebaute Komponenten durch Zentrifugation und/oder Größenausschlusschromatographie. Die Leistung der Stoffwechselnetzwerke wird in Echtzeit gemessen, indem das ATP/ADP-Verhältnis, die Metabolitenkonzentration, der interne pH-Wert oder andere Parameter durch Fluoreszenzauslesung überwacht werden. Unsere Membranprotein-haltigen Vesikel mit einem Durchmesser von 100-400 nm können mit bestehenden, aber optimierten Verfahren in riesig-unilamelläre Vesikel (GUVs) umgewandelt werden. Der Ansatz ermöglicht den Einbau löslicher Komponenten (Enzyme, Metaboliten, Sensoren) in mikrometergroße Vesikel, wodurch das Volumen der Bioreaktoren um Größenordnungen vergrößert wird. Das metabolische Netzwerk, das GUVs enthält, wird in mikrofluidischen Geräten gefangen, um sie mit optischer Mikroskopie zu analysieren.

Introduction

Der Bereich der synthetischen Biologie von unten konzentriert sich auf die Konstruktion von (minimalen) Zellen ^1,2 und metabolischen Bioreaktoren für biotechnologische ^3,4 oder biomedizinische Zwecke ^5,6,7,8. Die Konstruktion synthetischer Zellen bietet eine einzigartige Plattform, die es Forschern ermöglicht, (Membran-)Proteine unter genau definierten Bedingungen zu untersuchen, die denen der natürlichen Umgebung nachahmen, und ermöglicht so die Entdeckung von emergenten Eigenschaften und verborgenen biochemischen Funktionen von Proteinen und Reaktionsnetzwerken⁹. Als Zwischenschritt hin zu einer autonom funktionierenden synthetischen Zelle werden Module entwickelt, die wesentliche Merkmale lebender Zellen wie metabolische Energieerhaltung, Protein- und Lipidsynthese sowie Homöostase erfassen. Solche Module erweitern nicht nur unser Verständnis des Lebens, sondern haben auch Anwendungsmöglichkeiten in den Bereichen Medizin⁸ und Biotechnologie¹⁰.

Transmembranproteine sind das Herzstück praktisch jedes Stoffwechselnetzwerks, da sie Moleküle in oder aus der Zelle transportieren, Signale senden und auf die Qualität der Umwelt reagieren und zahlreiche biosynthetische Rollen spielen. Daher erfordert das Engineering von Stoffwechselmodulen in synthetischen Zellen in den meisten Fällen die Rekonstitution von integralen und/oder peripheren Membranproteinen zu einer Membrandoppelschicht, die aus spezifischen Lipiden besteht und eine hohe Integrität (geringe Permeabilität) aufweist. Der Umgang mit diesen Membranproteinen ist anspruchsvoll und erfordert spezifisches Wissen und experimentelle Fähigkeiten.

Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Membranproteine in Phospholipid-Vesikeln zu rekonstituieren, meist mit dem Ziel, die Funktion^11,12, die Regulation¹³, die kinetischen Eigenschaften^14,15, die Lipidabhängigkeit^15,16 und/oder die Stabilität¹⁷ eines spezifischen Proteins zu untersuchen. Diese Verfahren umfassen die rasche Verdünnung von durch Detergenzien gelöstem Protein in wässrigen Medien in Gegenwart von Lipiden¹⁸, die Entfernung von Detergenzien durch Inkubation von durch Detergenzien gelöstes Protein mit detergenzient destabilisierten Lipidvesikeln und die Absorption des Detergens bzw. der Detergenzien auf Polystyrolkügelchen¹⁹ oder das Entfernen von Detergenzien durch Dialyse oder Größenausschlusschromatographie²⁰. Organische Lösungsmittel wurden verwendet, um Lipidvesikel zu bilden, z. B. durch die Bildung von Öl-Wasser-Interphasen²¹, aber die Mehrzahl der integralen Membranproteine wird inaktiviert, wenn sie solchen Lösungsmitteln ausgesetzt werden.

In unserem Labor rekonstituieren wir hauptsächlich Membranproteine mit der Detergenz-Absorptionsmethode zu großen unilamellären Vesikeln (LUVs)¹⁹. Dieses Verfahren ermöglicht die Co-Rekonstitution mehrerer Membranproteine und die Verkapselung von Enzymen, Metaboliten und Sonden im Vesikellumen^22,23. Die Membranprotein-haltigen LUVs können in riesen-unilamelläre Vesikel (GUVs) mit/ohne Verkapselung wasserlöslicher Komponenten umgewandelt werden, wobei entweder die Elektroformation²⁴ oder die gelgestützte Quellung²⁵ und spezifische Bedingungen zur Erhaltung der Integrität der Membranproteine²⁶ verwendet werden.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Rekonstitution eines außerhalb des Gleichgewichts befindlichen metabolischen Netzwerks in LUVs vorgestellt, das ATP durch den Abbau von L-Arginin in L-Ornithin regeneriert²⁷. Die Bildung von ATP ist an die Produktion von Glycerin-3-phosphat (G3P) gekoppelt, einem wichtigen Baustein für die Phospholipidsynthese^22,28. Der Stoffwechselweg besteht aus zwei integralen Membranproteinen, einem Arginin/Ornithin (ArcD) und einem G3P/Pi-Antiporter (GlpT). Darüber hinaus werden drei lösliche Enzyme (ArcA, ArcB, ArcC) für das Recycling von ATP benötigt, und GlpK wird verwendet, um Glycerin in Glycerin-3-phosphat umzuwandeln, wobei das ATP aus dem Abbau von L-Arginin verwendet wird, siehe Abbildung 1 für einen schematischen Überblick über den Weg. Dieses Protokoll stellt einen guten Ausgangspunkt für den zukünftigen Aufbau noch komplexerer Reaktionsnetzwerke dar – für die Synthese von Lipiden oder Proteinen oder die Teilung von Zellen. Die Lipidzusammensetzung der Vesikel unterstützt die Aktivität einer Vielzahl von integralen Membranproteinen und wurde für den Transport verschiedener Moleküle in oder aus den Vesikeln optimiert 27,29,30.

Abbildung 1: Überblick über den Weg der ATP-Produktion und der Glycerin-3-phosphat-Synthese und -Ausscheidung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Kurz gesagt, gereinigte Membranproteine (solubilisiert in Dodecyl-β-D-Maltosid, DDM) werden zu vorgeformten Lipidvesikeln hinzugefügt, die mit Triton X-100 destabilisiert wurden, was die Insertion der Proteine in die Membran ermöglicht. Die Detergensmoleküle werden anschließend (langsam) durch die Zugabe von aktivierten Polystyrolkügelchen entfernt, was zur Bildung von gut verschlossenen Proteoliposomen führt. Lösliche Bestandteile können dann zu den Vesikeln hinzugefügt und über Gefrier-Tau-Zyklen verkapselt werden, wodurch die Moleküle im Prozess der Membranfusion eingefangen werden. Die gewonnenen Vesikel sind sehr heterogen und viele sind multilamell. Sie werden dann durch einen Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 400, 200 oder 100 nm extrudiert, was zu gleichmäßiger großen Vesikeln führt; Je kleiner die Porengröße, desto homogener und unilamellär sind die Vesikel, jedoch zum Preis eines kleineren inneren Volumens. Nicht eingebaute Proteine und kleine Moleküle werden durch Größenausschlusschromatographie aus der externen Lösung entfernt. Die proteoLUVs können durch gelgestütztes Aufquellen in mikrometergroße Vesikel umgewandelt werden, und diese proteoGUVs werden dann gesammelt und in einem mikrofluidischen Chip zur mikroskopischen Charakterisierung und Manipulation gefangen. Abbildung 2 zeigt einen schematischen Überblick über das gesamte Protokoll.

Abbildung 2: Überblick über das Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln mit Submikrometer- (LUVs) und Mikrometergröße (GUVs). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Rekonstitutions- und Verkapselungsprotokolle funktionieren gut und die Funktionalität der Proteine bleibt erhalten, aber die proteoLUVs und proteoGUVs sind heterogen groß. Mikrofluidische Ansätze ^31,32 ermöglichen die Bildung von mikrometergroßen Vesikel, die in ihrer Größe homogener sind, aber eine funktionelle Rekonstitution von Membranproteinen ist im Allgemeinen nicht möglich, da das restliche Lösungsmittel in der Doppelschicht die Proteine inaktiviert. Die ProteoLUVs haben eine Größe von 100 bis 400 nm, und bei niedrigen Enzymkonzentrationen kann die Verkapselung zu Vesikeln mit unvollständigen Stoffwechselwegen führen (stochastische Effekte; siehe Abbildung 3). LUVs sind ideal für den Aufbau spezifischer Stoffwechselmodule, wie hier gezeigt, für die Produktion von ATP und Bausteinen wie G3P. Solche proteoLUVs können möglicherweise in GUVs eingekapselt werden und als organellenähnliche Kompartimente für die Wirtsvesikel dienen.

Abbildung 3: Anzahl der Moleküle pro Vesikel mit einem Durchmesser von 100, 200 oder 400 nm. (A) Wenn die verkapselten Proteine (Enzyme, Sonden) im Bereich von 1-10 μM liegen. (B) Die Rekonstitution erfolgt bei 1 bis 1.000, 1 bis 10.000 und 1 bis 100.000 Membranproteinen pro Lipid (mol/mol). Wir gehen davon aus, dass Moleküle in den angegebenen Konzentrationen verkapselt und bei diesen Protein-Lipid-Verhältnissen in die Membran eingebaut werden. Bei einigen Enzymen haben wir gesehen, dass sie an Membranen binden, was ihre scheinbare Konzentration in den Vesikeln erhöhen kann. Abkürzung: LPR = Lipid-Protein-Ratio Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Allgemeine Vorbereitung ChemikalienLösen Sie Lipide (in Pulverform) auf 25 mg/ml in CHCl3 auf, um vorgeformte Liposomen herzustellen.HINWEIS: Es ist vorzuziehen, frische Lipide herzustellen, aber die Stammlösungen können auch einige Wochen bei -20 °C gelagert werden. Die Arbeit mit Lipiden in Pulverform ist genauer als die Verwendung von Lipiden, die bereits in CHCl3 solubilisiert sind. CHCl3 sollte mit Glaspipetten und/oder Spritzen gehandhab…

Representative Results

Die Rekonstitution von solubilisierten Membranproteinen in Liposomen erfordert die Destabilisierung von vorgeformten Vesikel. Die Zugabe geringer Mengen an Triton X-100 führt zunächst zu einer Erhöhung der Absorption bei 540 nm (A540) aufgrund einer Zunahme der Lichtstreuung durch die Schwellung der Vesikel (Abbildung 4). Der maximaleA-540-Wert ist der Punkt, an dem die Liposomen mit Detergens (Rsat) gesättigt sind, wonach jede weitere Zugabe von…

Discussion

Wir stellen ein Protokoll für die Synthese von (Membran-)Proteinen vor, die submikrometergroße Lipidvesikel (proteoLUVs) enthalten, und die Umwandlung von proteoLUVs in riesen-unilamelläre Vesikel (proteoGUVs). Das Protokoll sollte anwendbar sein für die Rekonstitution anderer Membranproteine^{13, 19, 30, 40} und die Verkapselung anderer Stoffwechselnetzwerke als der hier vorgestellten L-Argin…

Materials

Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	–
D(+)-Sucrose	Formedium	–
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g