שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי
Summary
שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Abstract
חלבוני שלד חיידקיים כגון FtsZ ו- MreB מבצעים פונקציות חיוניות כגון חלוקת תאים ושמירה על צורת התא. יתר על כן, FtsZ ו-MreB התגלו כמטרות חשובות לגילוי אנטי-מיקרוביאלי חדש. מספר בדיקות פותחו כדי לזהות תרכובות המכוונות לקשירת נוקלאוטידים ופילמור של חלבונים ציטו-שלד אלה, בעיקר בהתמקדות ב- FtsZ. יתר על כן, רבים מהבדיקות הן מייגעות או עתירות עלויות, וכדי לברר אם חלבונים אלה הם המטרה התאית של התרופה נדרשים לעתים קרובות שיטות מרובות. לבסוף, גם רעילות התרופות לתאים אאוקריוטים מהווה בעיה. במאמר זה אנו מתארים בדיקה חד-שלבית המבוססת על תאים כדי לגלות מולקולות חדשות המכוונות לשלד ציטוקלטון חיידקי ולמזער פגיעות שעלולות להיות רעילות לתאים איקריוטים. שמרי ביקוע מקובלים על מסכים בעלי תפוקה גבוהה המבוססים על מיקרוסקופיה, ומסך חזותי יכול לזהות בקלות כל מולקולה שמשנה את פילמור FtsZ או MreB. הבדיקה שלנו משתמשת בלוח 96 בארות סטנדרטי ומסתמכת על היכולת של חלבוני השלד הציטו-שלד החיידקיים להתפלמר בתא אאוקריוטי כגון שמרי הביקוע. בעוד שהפרוטוקולים המתוארים כאן הם עבור שמרי ביקוע ומשתמשים ב-FtsZ מ-Staphylococcus aureus וב-MreB מ-Escherichia coli, הם ניתנים להתאמה בקלות לחלבונים ציטו-שלדיים חיידקיים אחרים שמתאספים בקלות לפולימרים בכל פונדקאי ביטוי אאוקריוטי. השיטה המתוארת כאן אמורה לסייע בגילוי נוסף של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים המכוונים לחלבוני שלד חיידקיים.
Introduction
העמידות הנרחבת כמעט לכל האנטיביוטיקות המשמשות כיום למאבק בזיהומים חיידקיים יצרה צורך מיידי בקטגוריות חדשות של אנטיביוטיקה. דו”ח משנת 2019 הצביע על כך שזיהומים עמידים לאנטיביוטיקה גרמו לאובדן חייהם של 1.27 מיליון בני אדם, מה שתרם למספר כולל של 4.95 מיליון מקרי מוות כאשר לוקחים בחשבון סיבוכים של זיהומים חיידקיים עמידים1. בעוד שהוא עדיין יעיל בפרקטיקה הקלינית, ארסנל האנטיביוטיקה הנוכחי מכוון בעיקר לספקטרום צר של תהליכים תאיים, בעיקר התמקדות בדופן התא, דנ”א וסינתזה של חלבונים. במהלך חצי המאה האחרונה, פחות מ -30 חלבונים נוצלו באופן מסחרי כמטרות לפיתוח אנטי בקטריאלים חדשים 2,3. טווח מוגבל זה של מטרות בנות קיימא יוצר באופן משמעותי מגבלות לגילוי אנטיביוטיקה חדשה או נגזרותיה למאבק בחיידקים עמידים לאנטיביוטיקה. לכן, כדי להתגבר על בעיית העמידות לאנטיביוטיקה המתהווה, יש צורך בפיתוח אנטיביוטיקה חדשה עם מטרות ומנגנוני פעולה חדשים.
מטרה אנטיבקטריאלית צריכה באופן אידיאלי להיות מרכיב חיוני בצמיחת תאי חיידקים, להישמר בכל המינים המגוונים מבחינה פילוגנטית, להראות הכי פחות הומולוגיה אאוקריוטית, ולהיות נגישה לאנטיביוטיקה4. מאז גילוי חלבוני השלד הציטו-שלד החיידקיים המעורבים בחלוקת התא ובתחזוקת צורת התא, הם התגלו כמוקד מבטיח לפיתוח תרכובות אנטיבקטריאליות5. חלבונים אלה חיוניים לקיום חיידקים וממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על צורת התא (MreB, CreS), חלוקה (FtsZ, FtsA) והפרדת דנ”א (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), בדומה לשלד הציטוקריוטי בתאים איקריוטיים. יש לציין כי FtsZ מציג רמה גבוהה להפליא של שימור על פני מגוון רחב של אורגניזמים פרוקריוטים, בעוד MreB נמצא כמעט בכל החיידקים בצורת מוט. תפוצה כה רחבה ורלוונטיות בכדאיות התא הופכות חלבונים אלה למטרה מרתקת במחקר אנטיביוטי 5,6,7.
חיוני לאמץ גישה רב-זרועית המשלבת תצפיות in vivo, אינטראקציות במבחנה וניסויים אנזימטיים כדי לאמת ביסודיות חלבוני שלד חיידקי כמטרה העיקרית של מעכב פוטנציאלי7. הליכים מייגעים או השלכות עלות משמעותיות מכבידים על בדיקות זמינות רבות למטרה זו. אלה הם מכשולים בולטים לשימוש נרחב שלהם בסינון תרכובות עופרת שעלולות להשפיע על שלד החיידק. בין אלה, מיקרוסקופיה בולטת כשיטה יעילה ומהירה במיוחד להערכת יעילותן של תרכובות על ידי בחינה ישירה של שינויים במורפולוגיה של התא. עם זאת, האסוציאציה ההטרו-אסוציאטיבית של חלבון המטרה עם קומפלקסים ציטו-שלד אחרים, השפעות עקיפות הנובעות מקישור מחוץ למטרה ושינויים בפוטנציאל הממברנה, קושי לחדור לתא ביעילות, ונוכחות של משאבות אפלוקס, במיוחד בחיידקים גראם-שליליים, הופכים את איתור הגורם המדויק לעיוות תאי חיידקים 8,9,10 למורכב באופן קולקטיבי.
Schizosaccharomyces pombe, או שמרי ביקוע כפי שהם ידועים בדרך כלל, הוא אורגניזם איקריוטי חד-תאי בצורת מוט. שמרי ביקוע נמצאים בשימוש נרחב כאורגניזם מודל בביולוגיה תאית ומולקולרית בשל השימור יוצא הדופן בתהליכים תאיים כגון מחזור התא וחלוקתו, ארגון התא ושכפול כרומוזומים עם איקריוטים גבוהים יותר, כולל בני אדם11,12. יתר על כן, ארינגטון ועמיתיו ביטאו חלבון ציטו-שלד חיידקי מקומי בקוטב DivIVA בשמרי ביקוע כדי להדגים כי DivIVA הצטבר על משטחים מעוקלים שליליים13. שוב, Balasubramanian והקבוצה ביססו לראשונה שמרי ביקוע כמערכת מודל תאי כדי להביא תובנות חדשות על המנגנון, ההרכבה והדינמיקה של חלבון E. coli actin cytoskeleton כמו MreB14 ו tubulin homolog FtsZ15. הם גם מדגימים את היכולת של A22 לעכב ביעילות את פילמור MreB באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כאשר הוא מבוטא בשמרים14. בעקבות זאת, קבוצות אחרות השתמשו בהצלחה גם בשמרי ביקוע כדי לחקור את תכונות ההרכבה של חלבוני כלורופלסט FtsZ1 ו-FtsZ216. לאחרונה, ביססנו הוכחת היתכנות לכדאיות השימוש בשמרי ביקוע כפלטפורמה תאית לסינון ספציפי של מעכבי שלד ציטו-שלד חיידקי על ידי ביצוע הערכה מקיפה של ההשפעה של שלושה מעכבי FtsZ ידועים – סנגווינרין, ברברין וחלבוני FtsZ PC190723 שמקורם בשני חיידקים פתוגניים, כלומר סטפילוקוקוס זהוב והליקובקטר פילורי17. בנוסף, בדיקה חד-שלבית זו המבוססת על תאים מוכיחה את עצמה כחיונית במזעור הסיכון לזיהוי תרכובות שעלולות להיות רעילות לתאים איקריוטים.
בדו”ח זה, תוך שימוש במערכת שמרי הביקוע, אנו מציעים זרימת עבודה שיטתית באמצעות צלחת סטנדרטית של 96 בארות לסינון וכימות חצי-אוטומטיים של ההשפעה של מעכבי מולקולות קטנות המכוונים ל-FtsZ מ-Staphylococcus aureus ול-MreB מ-Escherichia coli. כאן, אנו מגדירים וממטבים את זרימת העבודה החצי-אוטומטית באמצעות המעכבים המבוססים PC190723 ו- A22 המכוונים ספציפית ל- FtsZ ו- MreB, בהתאמה. תהליך עבודה זה משתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בשלב ממונע בדיוק גבוה וברכישת תמונה אוטומטית בלוח סטנדרטי של 96 בארות כדי לשפר את התקינה הנוכחית. לפיכך, ניתן ליישם אותו על מסכים בעלי תפוקה בינונית וגבוהה של ספריות כימיות סינתטיות ולעקוף חלק מהאתגרים המפורטים לעיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא איום בריאותי עולמי רציני, ויש צורך דחוף באנטיביוטיקה חדשה עם מטרות חדשות. שלד הציטו-שלד החיידקי התגלה כיעד אטרקטיבי לפיתוח אנטיביוטיקה חדשה, עם מעכבי מולקולות קטנות של חלבון חלוקת התא FtsZ, כגון TXA709, שכבר נמצא בשלב I של ניסויים קליניים30. מספר שיטות פותח…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SMP, SR ו-AKS מכירים במלגות שהתקבלו מהמכון הלאומי לחינוך מדעי ומחקר, המחלקה לאנרגיה אטומית. RS מכירה בתמיכה במימון פנימי מהמחלקה לאנרגיה אטומית, ועבודה זו נתמכת באמצעות מענק מחקר ל-RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) מהמחלקה לביוטכנולוגיה (DBT). המחברים גם מודים ל- V Badireenath Konkimalla על הערותיו, הצעותיו ודיוניו לאורך פיתוח הפרוטוקול.
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
Riferimenti
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
- Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
- Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
- Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
- Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
- Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
- Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
- Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
- Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps – not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
- Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
- Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
- Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
- TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
- Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
- Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
- Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
- Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
- Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
- Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
- Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
- Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
- Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
- Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
- Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetica. 201 (2), 403-423 (2015).
- Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
- Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).
