बैक्टीरियल साइटोस्केलेटन प्रोटीन को लक्षित करने वाले जीवाणुरोधी दवा स्क्रीन के लिए एक मंच के रूप में विखंडन खमीर
Summary
विखंडन खमीर का उपयोग यहां बैक्टीरियल साइटोस्केलेटल प्रोटीन जैसे FtsZ और MreB को GFP के साथ ट्रांसलेशनल फ्यूजन प्रोटीन के रूप में व्यक्त करने के लिए उनके पोलीमराइजेशन की कल्पना करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, पोलीमराइजेशन को प्रभावित करने वाले यौगिकों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग द्वारा पहचाना जाता है।
Abstract
बैक्टीरियल साइटोस्केलेटल प्रोटीन जैसे FtsZ और MreB कोशिका विभाजन और कोशिका आकार के रखरखाव जैसे आवश्यक कार्य करते हैं। इसके अलावा, FtsZ और MreB उपन्यास रोगाणुरोधी खोज के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य के रूप में उभरे हैं। न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग और इन साइटोस्केलेटल प्रोटीन के पोलीमराइजेशन को लक्षित करने वाले यौगिकों की पहचान करने के लिए कई परख विकसित किए गए हैं, जो मुख्य रूप से FtsZ पर केंद्रित हैं। इसके अलावा, कई परख या तो श्रमसाध्य या लागत-गहन हैं, और यह पता लगाना कि क्या ये प्रोटीन दवा के सेलुलर लक्ष्य हैं, अक्सर कई तरीकों की आवश्यकता होती है। अंत में, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए दवाओं की विषाक्तता भी एक समस्या पैदा करती है। यहां, हम बैक्टीरियल साइटोस्केलेटन को लक्षित करने वाले उपन्यास अणुओं की खोज करने और यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए संभावित रूप से विषाक्त होने वाले हिट को कम करने के लिए एकल-चरण सेल-आधारित परख का वर्णन करते हैं। विखंडन खमीर माइक्रोस्कोपी पर आधारित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन के लिए उत्तरदायी है, और एक दृश्य स्क्रीन आसानी से किसी भी अणु की पहचान कर सकती है जो FtsZ या MreB के पोलीमराइजेशन को बदल देती है। हमारी परख मानक 96-अच्छी प्लेट का उपयोग करती है और बैक्टीरियल साइटोस्केलेटल प्रोटीन की क्षमता पर निर्भर करती है ताकि विखंडन खमीर जैसे यूकेरियोटिक सेल में पोलीमराइज़ किया जा सके। जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल विखंडन खमीर के लिए हैं और एस्चेरिचिया कोलाई से स्टैफिलोकोकस ऑरियस और एमआरईबी से एफटीएसजेड का उपयोग करते हैं, वे आसानी से अन्य बैक्टीरियल साइटोस्केलेटल प्रोटीन के अनुकूल होते हैं जो आसानी से किसी भी यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति मेजबानों में पॉलिमर में इकट्ठा होते हैं। यहां वर्णित विधि को बैक्टीरियल साइटोस्केलेटल प्रोटीन को लक्षित करने वाले उपन्यास रोगाणुरोधी की आगे की खोज को सुविधाजनक बनाने में मदद करनी चाहिए।
Introduction
वर्तमान में जीवाणु संक्रमण से निपटने के लिए नियोजित लगभग सभी एंटीबायोटिक दवाओं के व्यापक प्रतिरोध ने एंटीबायोटिक दवाओं की नई श्रेणियों के लिए तत्काल आवश्यकता पैदा की है। 2019 की एक रिपोर्ट ने संकेत दिया कि एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी संक्रमणों के परिणामस्वरूप 1.27 मिलियन लोगों की जान चली गई, प्रतिरोधी जीवाणु संक्रमण से जटिलताओं पर विचार करते समय 4.95 मिलियन मौतों की कुल संख्या में योगदानदिया। जबकि नैदानिक अभ्यास में अभी भी प्रभावी है, एंटीबायोटिक दवाओं का वर्तमान शस्त्रागार मुख्य रूप से सेलुलर प्रक्रियाओं के एक संकीर्ण स्पेक्ट्रम को लक्षित करता है, मुख्य रूप से सेल दीवार, डीएनए और प्रोटीन संश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करता है। पिछली आधी सदी में, कम से कम 30 प्रोटीन व्यावसायिक रूप से नए विरोधी बैक्टीरियल 2,3 के विकास के लिए लक्ष्य के रूप में शोषण किया गया है. व्यवहार्य लक्ष्यों की यह सीमित सीमा एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी बैक्टीरिया का मुकाबला करने के लिए नए एंटीबायोटिक दवाओं या उनके डेरिवेटिव की खोज में काफी बाधाएं पैदा करती है। इस प्रकार, उभरती एंटीबायोटिक प्रतिरोध समस्या को दूर करने के लिए, उपन्यास लक्ष्यों और कार्रवाई के तंत्र के साथ नए एंटीबायोटिक दवाओं के विकास की आवश्यकता है।
एक जीवाणुरोधी लक्ष्य आदर्श रूप से बैक्टीरिया कोशिका वृद्धि का एक अनिवार्य घटक होना चाहिए, फाइलोजेनेटिक रूप से विविध प्रजातियों में संरक्षित होना चाहिए, कम से कम यूकेरियोटिक होमोलॉजी दिखाना चाहिए, और एंटीबायोटिक दवाओं के लिए सुलभ होनाचाहिए। कोशिका विभाजन और कोशिका आकार रखरखाव में शामिल बैक्टीरियल साइटोस्केलेटल प्रोटीन की खोज के बाद से, वे जीवाणुरोधी यौगिकों के विकास के लिए एक आशाजनक केंद्र बिंदु के रूप में उभरेहैं। ये प्रोटीन बैक्टीरिया की व्यवहार्यता के लिए आवश्यक हैं और सेल आकार (MreB, CreS), विभाजन (FtsZ, FtsA), और डीएनए अलगाव (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA) को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में साइटोस्केलेटन के समान। विशेष रूप से, FtsZ प्रोकैरियोटिक जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में उल्लेखनीय रूप से उच्च स्तर के संरक्षण को प्रदर्शित करता है, जबकि MreB लगभग सभी रॉड के आकार के बैक्टीरिया में पाया जाता है। सेल व्यवहार्यता में इस तरह के व्यापक वितरण और प्रासंगिकता इन प्रोटीनों एंटीबायोटिक अनुसंधान 5,6,7 में एक आकर्षक लक्ष्य बनाते हैं.
यह एक बहु-आयामी दृष्टिकोण को अपनाने के लिए महत्वपूर्ण है जो विवो टिप्पणियों में, इन विट्रो इंटरैक्शन में, और एंजाइमेटिक प्रयोगों को अच्छी तरह से एक संभावित अवरोधक7 के प्राथमिक लक्ष्य के रूप में बैक्टीरियल साइटोस्केलेटन प्रोटीन को मान्य करने के लिए जोड़ता है। श्रमसाध्य प्रक्रियाएं या पर्याप्त लागत निहितार्थ इस उद्देश्य के लिए कई उपलब्ध assays को बाधित करते हैं। ये स्क्रीनिंग लीड यौगिकों में उनके व्यापक उपयोग के लिए उल्लेखनीय बाधाएं हैं जो बैक्टीरियल साइटोस्केलेटन को प्रभावित कर सकते हैं। इनमें से, माइक्रोस्कोपी सीधे सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन की जांच करके यौगिकों की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक असाधारण कुशल और तेज़ विधि के रूप में सामने आता है। फिर भी, अन्य साइटोस्केलेटन परिसरों के साथ लक्ष्य प्रोटीन के विषम संघ, बंद लक्ष्य बाध्यकारी और झिल्ली क्षमता में परिवर्तन के कारण अप्रत्यक्ष प्रभाव, कुशलता से सेल मर्मज्ञ में कठिनाई, और तपका पंपों की उपस्थिति, विशेष रूप से ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में, यह सामूहिक रूप से जटिल बनाने के लिए बैक्टीरिया सेल विरूपण 8,9,10 का सटीक कारण इंगित करने के लिए.
Schizosaccharomyces pombe, या विखंडन खमीर जैसा कि आमतौर पर जाना जाता है, एक रॉड के आकार का एककोशिकीय यूकेरियोटिक जीव है। विखंडन खमीर व्यापक रूप से सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान में एक मॉडल जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है इस तरह के सेल चक्र और विभाजन, सेलुलर संगठन, और उच्च यूकेरियोट्स के साथ गुणसूत्र प्रतिकृति के साथ असाधारण संरक्षण के कारण, मनुष्यों11,12 सहित. इसके अलावा, एरिंगटन और सहयोगियों ने विखंडन खमीर में एक ध्रुव-स्थानीयकृत जीवाणु साइटोस्केलेटल प्रोटीन डिविवा व्यक्त किया ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि डिविवा नकारात्मक घुमावदार सतहों13 पर जमा हुआ है। फिर से, बालासुब्रमण्यम और समूह ने पहली बार विखंडन खमीर को एक सेलुलर मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया था ताकि ई कोलाई एक्टिन साइटोस्केलेटन प्रोटीन जैसे एमआरईबी14 और ट्यूबुलिन होमोलॉग एफटीएसजेड15 की तंत्र, संयोजन और गतिशीलता में नई अंतर्दृष्टि लाई जा सके। वे खमीर 14 में व्यक्त किए जाने पर एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एमआरईबी के पोलीमराइजेशन को कुशलतापूर्वक बाधित करने के लिए ए22 की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। इसके बाद, अन्य समूहों ने क्लोरोप्लास्ट FtsZ1 और FtsZ2 प्रोटीन16 के विधानसभा गुणों का अध्ययन करने के लिए विखंडन खमीर को सफलतापूर्वक नियोजित किया है। हाल ही में, हमने तीन ज्ञात FtsZ अवरोधकों-sanguinarine, berberine, और PC190723-on FtsZ प्रोटीन के प्रभाव का व्यापक मूल्यांकन करके बैक्टीरियल साइटोस्केलेटन अवरोधकों के लिए विशेष रूप से स्क्रीन के रूप में एक सेलुलर प्लेटफॉर्म के रूप में विखंडन खमीर के उपयोग की व्यवहार्यता की एक प्रूफ-ऑफ-अवधारणा स्थापित की है, अर्थात् स्टैफिलोकोकस ऑरियस और हेलिकोबैक्टर पाइलोरी17. इसके अतिरिक्त, यह एकल-चरण सेल-आधारित परख यौगिकों की पहचान करने के जोखिम को कम करने में महत्वपूर्ण साबित होता है जो यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए संभावित रूप से विषाक्त हो सकते हैं।
इस रिपोर्ट में, विखंडन खमीर प्रणाली का उपयोग, हम अर्ध स्वचालित स्क्रीनिंग और Escherichia कोलाई से Staphylococcus aureus और MreB से FtsZ को लक्षित छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव की मात्रा का ठहराव के लिए मानक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह का प्रस्ताव. यहां, हम स्थापित अवरोधकों PC190723 और A22 का उपयोग करके अर्ध-स्वचालित वर्कफ़्लो को सेट और अनुकूलित करते हैं जो विशेष रूप से क्रमशः FtsZ और MreB को लक्षित करते हैं। इस कार्यप्रवाह एक epifluorescence खुर्दबीन एक मोटर चालित उच्च परिशुद्धता मंच और एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली में स्वचालित छवि अधिग्रहण के साथ सुसज्जित का उपयोग करता है वर्तमान मानकीकरण पर सुधार करने के लिए. इसलिए, इसे सिंथेटिक रासायनिक पुस्तकालयों के मध्यम और साथ ही उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है और ऊपर सूचीबद्ध कुछ चुनौतियों को दरकिनार कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) एक गंभीर वैश्विक स्वास्थ्य खतरा है, और नए लक्ष्यों के साथ नए एंटीबायोटिक दवाओं की तत्काल आवश्यकता है। बैक्टीरियल साइटोस्केलेटन नए एंटीबायोटिक दवाओं के विकास के लिए एक आकर…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसएमपी, एसआर और एकेएस राष्ट्रीय विज्ञान शिक्षा और अनुसंधान संस्थान, परमाणु ऊर्जा विभाग से प्राप्त फैलोशिप को स्वीकार करते हैं। आरएस परमाणु ऊर्जा विभाग से इंट्राम्यूरल फंडिंग सहायता को स्वीकार करता है, और यह कार्य जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी) से आरएस (बीटी/PR42977/एमईडी/29/1603/2022) को अनुसंधान अनुदान के माध्यम से समर्थित है। लेखक प्रोटोकॉल के विकास के दौरान अपनी टिप्पणियों, सुझावों और चर्चाओं के लिए वी बदिरीनाथ कोंकिमल्ला को भी स्वीकार करते हैं।
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
Riferimenti
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