Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.
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Articolo metodologico
Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine del citoscheletro batterico come FtsZ e MreB svolgono funzioni essenziali come la divisione cellulare e il mantenimento della forma cellulare. Inoltre, FtsZ e MreB sono emersi come obiettivi importanti per la scoperta di nuovi antimicrobici. Sono stati sviluppati diversi saggi per identificare composti che hanno come bersaglio il legame nucleotidico e la polimerizzazione di queste proteine del citoscheletro, principalmente focalizzati su FtsZ. Inoltre, molti dei test sono laboriosi o costosi e l'accertamento di queste proteine come bersaglio cellulare del farmaco richiede spesso più metodi. Infine, anche la tossicità dei farmaci per le cellule eucariotiche pone un problema. Qui, descriviamo un saggio basato su cellule in un'unica fase per scoprire nuove molecole che prendono di mira il citoscheletro batterico e ridurre al minimo i colpi che potrebbero essere potenzialmente tossici per le cellule eucariotiche. Il lievito di fissione è suscettibile di screening ad alto rendimento basati sulla microscopia e uno screening visivo può facilmente identificare qualsiasi molecola che altera la polimerizzazione di FtsZ o MreB. Il nostro test utilizza la piastra standard a 96 pozzetti e si basa sulla capacità delle proteine del citoscheletro batterico di polimerizzare in una cellula eucariotica come il lievito di fissione. Sebbene i protocolli qui descritti siano per il lievito di fissione e utilizzino FtsZ da Staphylococcus aureus e MreB da Escherichia coli, sono facilmente adattabili ad altre proteine citoscheletriche batteriche che si assemblano facilmente in polimeri in qualsiasi ospite di espressione eucariotica. Il metodo qui descritto dovrebbe aiutare a facilitare l'ulteriore scoperta di nuovi antimicrobici che prendono di mira le proteine del citoscheletro batterico.
Introduzione
La diffusa resistenza a quasi tutti gli antibiotici attualmente impiegati per combattere le infezioni batteriche ha creato un'immediata necessità di nuove categorie di antibiotici. Un rapporto del 2019 ha indicato che le infezioni resistenti agli antibiotici hanno provocato la perdita di 1,27 milioni di vite, contribuendo a un conteggio complessivo di 4,95 milioni di decessi se si considerano le complicanze delle infezioni batteriche resistenti1. Sebbene sia ancora efficace nella pratica clinica, l'attuale arsenale di antibiotici si rivolge prevalentemente a uno spettro ristretto di processi cellulari, concentrandosi principalmente sulla parete....
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Protocollo
1. Espressione di proteine del citoscheletro batterico marcate con GFP in S. pombe
NOTA: Si prega di consultare la Tabella 1 per informazioni su tutti i plasmidi e i ceppi utilizzati qui. Si prega di consultare la Tabella 2 per tutte le composizioni multimediali.
- Eseguire il clonaggio di MreB di E. coli con una fusione GFP N-terminale (GFP-MreB) e FtsZ di S. aureus che trasporta una GFP C-terminale (SaFtsZ-GFP) nel vettore di espressione di S. pombe, pREP42 con un promotore repressibile di tiamina di media potenza, nmt41
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Risultati
Allestimento della piastra a 96 pozzetti per lo screening dei farmaci
L'uso di S. pombe per esprimere una GFP C-terminale marcata con S. aureus FtsZ da un vettore (pREP42) contenente il promotore repressibile della tiamina nmt41a media forza è stato precedentemente stabilito17 e, analogamente, anche l'MreB di E. coli marcato con GFP N-terminale è stato espresso in S. pombe14. Abbiamo anche dimostrato che PC190.......
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Discussione
La resistenza antimicrobica (AMR) è una grave minaccia per la salute globale e c'è un urgente bisogno di nuovi antibiotici con nuovi bersagli. Il citoscheletro batterico è emerso come un bersaglio interessante per lo sviluppo di nuovi antibiotici, con inibitori di piccole molecole della proteina di divisione cellulare FtsZ, come TXA709, già in studi clinici di fase I30. Sono stati sviluppati diversi metodi per identificare gli inibitori della polimerizzazione di FtsZ 7.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
SMP, SR e AKS riconoscono le borse di studio ricevute dal National Institute of Science Education and Research, Dipartimento di Energia Atomica. RS riconosce il sostegno finanziario intramurale del Dipartimento di Energia Atomica e questo lavoro è supportato da una sovvenzione di ricerca a RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT). Gli autori ringraziano anche V Badireenath Konkimalla per i suoi commenti, suggerimenti e discussioni durante lo sviluppo del protocollo.
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Materiali
Sali x 50 forte
160376CLS3370317275202398Vitamine (stock x 1000)1 mL/L (v/v)Minerali (Stock x 10.000)0,1 mL/L (v/v)
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 96 pozzetti CC2 ottico CVG sterile, con coperchio. Nero | Thermo Scientific™ | ||
| piastra a 96 pozzetti | Corning | ||
| A22 cloridrato | Sigma | SML0471 | Disciolto in DMSO |
| Adenina | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L di terreno |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | ||
| Edinburg minimo medium (EMM Agar o EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | Vedi sotto per la composizione |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 con cursore a 2 posizioni | Eppendorf | 5069000101 | |
| Istidina | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L di terreno |
| Microscopio a fluorescenza invertita Leica DMi8 | Leica Microsystems | Azienda tedesca | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L di terreno |
| Acetato di litio | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Disciolto in DMSO |
| Polietilenglicole (PEG) | Sigma | ||
| Filtro Tiamina | Sigma | T4625 | sterilizzato |
| Tris-cloridrato | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L di terreno, Conservare la soluzione a 36 gradi; C |
| SÌ (Estratto di lievito + integratori) Agar | FormediumTM | PCM0410 | Vedi sotto per la composizione |
| SÌ (Estratto di lievito + integratori) Brodo | FormediumTM | PCM0310 | Vedi sotto per la composizione |
| Lievito (S. pombe) media | |||
| Estratto di lievito + integratori (YES) | |||
| Composizione | g/L | ||
| Estratto di lievito | 5 | ||
| Destrosio | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenina | 0,05 | ||
| L-Istidina | 0,05 | ||
| L-Leucina | 0,05 | ||
| L-Lisina HCl | 0,05 | ||
| Uracile | 0,05 | ||
| Edinburg medio minimo (EMM) | |||
| Composizione | g/L | concentrazione | |
| ftalato di idrogeno di potassio | 3 | 14,7 mM | |
| Na2HPO4 | 2,2 | 15,5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93,5 mM | |
| di glucosio | 2% (p/v) o 20 g/L | 111 mM | |
| Sali (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| 52,5 g/l MgCl2,6H20 (0,26 M) | 52,5 | 0,26 M | |
| 0,735 mg/l CaCl2,2H20 (4,99 mM) | 0,000735 | 4,99 mM | |
| 50 g/l KCl (0,67 M) | 50 | 0,67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14,l mM) | 2 | 14,1 mM | |
| Vitamine x 1000 | 1 g/l di acido pantotenico | 1 | 4,20 mM |
| 10 g/l di acido nicotinico | 10 | 81,2 mM | |
| 10 g/l di inositolo | 10 | 55,5 mM | |
| 10 mg/l di biotina | 0,01 | 40,8 µ M | |
| Minerali x 10.000 | borico | 5 | 80,9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23,7 mM | |
| ZnSO4,7H2O | 4 | 13,9 mM | |
| FeCl2,6H2O | 2 | 7,40 mM | |
| di acido molibdico | 0,4 | 2,47 mM | |
| KI | 1 | 6,02 mM | |
| di CuSO4,5H2O | 0,4 | 1,60 mM | |
| di acido citrico | 10 | 47,6 mM | |
| Ceppi/ Plasmidi | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmidi | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
Riferimenti
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as ....
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Ristampe e permessi
