Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico
Summary
Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Abstract
Le proteine del citoscheletro batterico come FtsZ e MreB svolgono funzioni essenziali come la divisione cellulare e il mantenimento della forma cellulare. Inoltre, FtsZ e MreB sono emersi come obiettivi importanti per la scoperta di nuovi antimicrobici. Sono stati sviluppati diversi saggi per identificare composti che hanno come bersaglio il legame nucleotidico e la polimerizzazione di queste proteine del citoscheletro, principalmente focalizzati su FtsZ. Inoltre, molti dei test sono laboriosi o costosi e l’accertamento di queste proteine come bersaglio cellulare del farmaco richiede spesso più metodi. Infine, anche la tossicità dei farmaci per le cellule eucariotiche pone un problema. Qui, descriviamo un saggio basato su cellule in un’unica fase per scoprire nuove molecole che prendono di mira il citoscheletro batterico e ridurre al minimo i colpi che potrebbero essere potenzialmente tossici per le cellule eucariotiche. Il lievito di fissione è suscettibile di screening ad alto rendimento basati sulla microscopia e uno screening visivo può facilmente identificare qualsiasi molecola che altera la polimerizzazione di FtsZ o MreB. Il nostro test utilizza la piastra standard a 96 pozzetti e si basa sulla capacità delle proteine del citoscheletro batterico di polimerizzare in una cellula eucariotica come il lievito di fissione. Sebbene i protocolli qui descritti siano per il lievito di fissione e utilizzino FtsZ da Staphylococcus aureus e MreB da Escherichia coli, sono facilmente adattabili ad altre proteine citoscheletriche batteriche che si assemblano facilmente in polimeri in qualsiasi ospite di espressione eucariotica. Il metodo qui descritto dovrebbe aiutare a facilitare l’ulteriore scoperta di nuovi antimicrobici che prendono di mira le proteine del citoscheletro batterico.
Introduction
La diffusa resistenza a quasi tutti gli antibiotici attualmente impiegati per combattere le infezioni batteriche ha creato un’immediata necessità di nuove categorie di antibiotici. Un rapporto del 2019 ha indicato che le infezioni resistenti agli antibiotici hanno provocato la perdita di 1,27 milioni di vite, contribuendo a un conteggio complessivo di 4,95 milioni di decessi se si considerano le complicanze delle infezioni batteriche resistenti1. Sebbene sia ancora efficace nella pratica clinica, l’attuale arsenale di antibiotici si rivolge prevalentemente a uno spettro ristretto di processi cellulari, concentrandosi principalmente sulla parete cellulare, sul DNA e sulla sintesi proteica. Nell’ultimo mezzo secolo, meno di 30 proteine sono state sfruttate commercialmente come bersagli per lo sviluppo di nuovi antibatterici 2,3. Questa gamma limitata di bersagli praticabili crea in modo significativo vincoli alla scoperta di nuovi antibiotici o dei loro derivati per combattere i batteri resistenti agli antibiotici. Pertanto, per superare il problema emergente della resistenza agli antibiotici, è necessario lo sviluppo di nuovi antibiotici con nuovi bersagli e meccanismi d’azione.
Un bersaglio antibatterico dovrebbe idealmente essere una componente essenziale della crescita delle cellule batteriche, essere conservato in tutte le specie filogeneticamente diverse, mostrare meno omologia eucariotica ed essere accessibile agli antibiotici4. Dalla scoperta delle proteine del citoscheletro batterico coinvolte nella divisione cellulare e nel mantenimento della forma cellulare, sono emerse come un promettente punto focale per lo sviluppo di composti antibatterici5. Queste proteine sono essenziali per la vitalità batterica e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della forma cellulare (MreB, CreS), della divisione (FtsZ, FtsA) e della segregazione del DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), simili al citoscheletro nelle cellule eucariotiche. In particolare, FtsZ mostra un livello notevolmente elevato di conservazione in un’ampia gamma di organismi procarioti, mentre MreB si trova in quasi tutti i batteri a forma di bastoncello. Una distribuzione così ampia e rilevante nella vitalità cellulare rendono queste proteine un bersaglio affascinante nella ricerca sugli antibiotici 5,6,7.
È fondamentale adottare un approccio su più fronti che combini osservazioni in vivo, interazioni in vitro ed esperimenti enzimatici per convalidare a fondo le proteine del citoscheletro batterico come bersaglio primario di un potenziale inibitore7. Procedure laboriose o sostanziali implicazioni di costo gravano su molti test disponibili per questo scopo. Questi sono notevoli ostacoli al loro utilizzo diffuso nello screening di composti guida che potrebbero avere un impatto sul citoscheletro batterico. Tra questi, la microscopia si distingue come un metodo eccezionalmente efficiente e rapido per valutare l’efficacia dei composti esaminando direttamente i cambiamenti nella morfologia cellulare. Tuttavia, l’etero-associazione della proteina bersaglio con altri complessi del citoscheletro, gli effetti indiretti dovuti al legame off-target e ai cambiamenti nel potenziale di membrana, la difficoltà a penetrare efficacemente nella cellula e la presenza di pompe di efflusso, specialmente nei batteri Gram-negativi, rendono collettivamente complesso individuare la causa precisa della deformazione della cellula batterica 8,9,10.
Lo Schizosaccharomyces pombe, o lievito di fissione come è comunemente noto, è un organismo eucariotico unicellulare a forma di bastoncello. Il lievito di fissione è ampiamente utilizzato come organismo modello in biologia cellulare e molecolare a causa della straordinaria conservazione nei processi cellulari come il ciclo e la divisione cellulare, l’organizzazione cellulare e la replicazione cromosomica con eucarioti superiori, compresi gli esseri umani11,12. Inoltre, Errington e colleghi hanno espresso una proteina citoscheletrica batterica localizzata ai poli DivIVA nel lievito di fissione per dimostrare che DivIVA si accumulava su superfici curve negativamente13. Ancora una volta, Balasubramanian e il gruppo avevano stabilito per la prima volta il lievito di fissione come sistema modello cellulare per portare nuove intuizioni sul meccanismo, l’assemblaggio e la dinamicità della proteina del citoscheletro di actina di E. coli come MreB14 e l’omologo della tubulina FtsZ15. Dimostrano anche la capacità di A22 di impedire efficacemente la polimerizzazione di MreB attraverso la microscopia a epifluorescenza quando espresso nel lievito14. In seguito, anche altri gruppi hanno impiegato con successo il lievito di fissione per studiare le proprietà di assemblaggio delle proteine FtsZ1 e FtsZ2 dei cloroplasti16. Più recentemente, abbiamo stabilito una prova di concetto della fattibilità dell’uso del lievito di fissione come piattaforma cellulare per lo screening specifico degli inibitori del citoscheletro batterico conducendo una valutazione completa dell’impatto di tre noti inibitori di FtsZ: sanguinarina, berberina e PC190723-on proteine FtsZ derivate da due batteri patogeni, vale a dire Staphylococcus aureus e Helicobacter pylori17. Inoltre, questo test basato su cellule in un’unica fase si rivela fondamentale per ridurre al minimo il rischio di identificare composti che potrebbero essere potenzialmente tossici per le cellule eucariotiche.
In questo rapporto, utilizzando il sistema del lievito di fissione, proponiamo un flusso di lavoro sistematico utilizzando la piastra standard a 96 pozzetti per lo screening semiautomatico e la quantificazione dell’effetto di inibitori di piccole molecole che prendono di mira FtsZ da Staphylococcus aureus e MreB da Escherichia coli. Qui, abbiamo impostato e ottimizzato il flusso di lavoro semi-automatizzato utilizzando gli inibitori consolidati PC190723 e A22 che mirano specificamente rispettivamente a FtsZ e MreB. Questo flusso di lavoro utilizza un microscopio a epifluorescenza dotato di un tavolino motorizzato ad alta precisione e l’acquisizione automatizzata delle immagini in una piastra standard a 96 pozzetti per migliorare l’attuale standardizzazione. Pertanto, può essere applicato a schermi a medio e alto rendimento di librerie chimiche sintetiche e aggira alcune delle sfide sopra elencate.
Protocol
Representative Results
Discussion
La resistenza antimicrobica (AMR) è una grave minaccia per la salute globale e c’è un urgente bisogno di nuovi antibiotici con nuovi bersagli. Il citoscheletro batterico è emerso come un bersaglio interessante per lo sviluppo di nuovi antibiotici, con inibitori di piccole molecole della proteina di divisione cellulare FtsZ, come TXA709, già in studi clinici di fase I30. Sono stati sviluppati diversi metodi per identificare gli inibitori della polimerizzazione di FtsZ <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SMP, SR e AKS riconoscono le borse di studio ricevute dal National Institute of Science Education and Research, Dipartimento di Energia Atomica. RS riconosce il sostegno finanziario intramurale del Dipartimento di Energia Atomica e questo lavoro è supportato da una sovvenzione di ricerca a RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT). Gli autori ringraziano anche V Badireenath Konkimalla per i suoi commenti, suggerimenti e discussioni durante lo sviluppo del protocollo.
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
Riferimenti
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