핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.
FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질은 세포 분열 및 세포 형태 유지와 같은 필수 기능을 수행합니다. 또한 FtsZ와 MreB는 새로운 항균제 발견을 위한 중요한 표적으로 부상했습니다. 이러한 세포골격 단백질의 뉴클레오티드 결합 및 중합을 표적으로 하는 화합물을 식별하기 위해 여러 분석법이 개발되었으며, 주로 FtsZ에 초점을 맞추고 있습니다. 더욱이, 많은 분석법은 힘들거나 비용이 많이 들며, 이러한 단백질이 약물의 세포 표적인지 여부를 확인하려면 여러 가지 방법이 필요한 경우가 많습니다. 마지막으로, 진핵 세포에 대한 약물의 독성도 문제를 제기합니다. 여기에서는 박테리아 세포골격을 표적으로 하는 새로운 분자를 발견하고 진핵 세포에 잠재적으로 독성이 있을 수 있는 공격을 최소화하기 위한 단일 단계 세포 기반 분석에 대해 설명합니다. 핵분열 효모는 현미경을 기반으로 한 고처리량 스크리닝에 적합하며, 육안 스크리닝은 FtsZ 또는 MreB의 중합을 변경하는 모든 분자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 당사의 분석은 표준 96웰 플레이트를 사용하며 분열 효모와 같은 진핵 세포에서 중합하는 박테리아 세포골격 단백질의 능력에 의존합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 핵분열 효모에 대한 것이며 황색포도상구균 의 FtsZ와 대장균의 MreB를 활용하지만, 모든 진핵생물 발현 호스트에서 고분자로 쉽게 조립되는 다른 박테리아 세포골격 단백질에 쉽게 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 새로운 항균제의 추가 발견을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.
현재 세균 감염을 퇴치하기 위해 사용되는 거의 모든 항생제에 대한 광범위한 내성으로 인해 새로운 범주의 항생제가 즉시 필요하게 되었습니다. 2019년 보고서에 따르면 항생제 내성 감염으로 인해 127만 명이 목숨을 잃었으며, 내성 세균 감염으로 인한 합병증을 고려할 때 총 495만 명이 사망한 것으로 집계되었습니다1. 임상에서는 여전히 효과적이지만, 현재 사용되는 항생제는 주로 세포벽, DNA 및 단백질 합성에 초점을 맞춘 좁은 범위의 세포 과정을 표적으로 합니다. 지난 반세기 동안 새로운 항균제 2,3 개발의 대상으로 상업적으로 이용된 단백질은 30개 미만입니다. 이처럼 실행 가능한 표적의 범위가 제한되어 있기 때문에 항생제 내성 박테리아와 싸우기 위한 새로운 항생제 또는 그 유도체를 발견하는 데 상당한 제약이 있습니다. 따라서 새로운 항생제 내성 문제를 극복하기 위해서는 새로운 표적과 작용 기전을 가진 새로운 항생제의 개발이 필요합니다.
항균 표적은 이상적으로 박테리아 세포 성장의 필수 구성 요소여야 하고, 계통 발생학적으로 다양한 종 전체에 걸쳐 보존되어야 하며, 진핵생물 상동성이 가장 적어야 하고, 항생제에 접근할 수 있어야 한다4. 세포 분열 및 세포 형태 유지에 관여하는 세균성 세포골격 단백질의 발견 이후, 항균 화합물 개발을 위한 유망한 초점으로 부상했다5. 이 단백질은 박테리아의 생존력에 필수적이며 진핵 세포의 세포골격과 유사한 세포 모양(MreB, CreS), 분열(FtsZ, FtsA) 및 DNA 분리(ParM, TubZ, PhuZ, AlfA)를 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 특히, FtsZ는 광범위한 원핵 생물에서 매우 높은 수준의 보존을 보이는 반면, MreB는 거의 모든 막대 모양의 박테리아에서 발견됩니다. 세포 생존력에 대한 이러한 광범위한 분포와 관련성으로 인해 이러한 단백질은 항생제 연구에서 매력적인 표적이 됩니다 5,6,7.
di vivo 관찰, in vitro 상호작용 및 효소 실험을 결합한 다각적인 접근법을 채택하여 잠재적 억제제의 주요 표적인 박테리아 세포골격 단백질을 철저히 검증하는 것이 중요합니다7. 번거로운 절차나 상당한 비용 문제로 인해 이러한 목적을 위해 사용 가능한 많은 분석법이 어려움을 겪고 있습니다. 이는 박테리아 세포골격에 영향을 미칠 수 있는 납 화합물을 스크리닝하는 데 널리 사용되는 데 주목할 만한 장애물입니다. 이 중 현미경 검사는 세포 형태의 변화를 직접 검사하여 화합물의 효과를 평가하는 매우 효율적이고 신속한 방법으로 두드러집니다. 그러나 표적 단백질과 다른 세포골격 복합체의 이종 연관성, off-target 결합 및 막 전위의 변화로 인한 간접 효과, 세포에 효율적으로 침투하기 어려운 점, 특히 그람 음성 박테리아에서 유출 펌프의 존재로 인해 박테리아 세포 변형의 정확한 원인을 정확히 찾아내는 것이 총체적으로 복잡합니다 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe 또는 일반적으로 알려진 핵분열 효모는 막대 모양의 단세포 진핵 생물입니다. 핵분열 효모는 세포주기 및 분열, 세포 조직 및 염색체 복제와 같은 세포 과정의 탁월한 보존으로 인해 세포 및 분자 생물학에서 모델 유기체로 널리 사용됩니다11,12. 더욱이, Errington과 동료들은 핵분열 효모에서 극 국소화된 박테리아 세포골격 단백질 DivIVA를 발현하여 DivIVA가 음의 곡면13에 축적되었음을 입증했다. 다시 말하지만, Balasubramanian과 그의 연구는 MreB14 및 tubulin homolog FtsZ15와 같은 E. coli actin cytoskeleton 단백질의 메커니즘, 조립 및 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 위해 세포 모델 시스템으로 핵분열 효모를 처음으로 확립했습니다. 또한 효모14에서 발현될 때 에피형광 현미경을 통해 MreB의 중합을 효율적으로 방해하는 A22의 능력을 보여줍니다. 그 후, 다른 그룹들도 엽록체 FtsZ1 및 FtsZ2 단백질의 조립 특성을 연구하기 위해 핵분열 효모를 성공적으로 사용하였다16. 보다 최근에는 황색포도상구균 및 헬리코박터 파일로리 17에서 유래한 알려진 세 가지 FtsZ 억제제(sanguinarine, berberine 및 PC190723-on FtsZ protein)의 영향에 대한 포괄적인 평가를 수행하여 박테리아 세포골격 억제제를 특이적으로 스크리닝하기 위한 세포 플랫폼으로서의 핵분열 효모 사용의 실행 가능성에 대한 개념 증명을 확립했습니다. 또한 이 단일 단계 세포 기반 분석은 진핵 세포에 잠재적으로 독성이 있을 수 있는 화합물을 식별하는 위험을 최소화하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다.
이 보고서에서는 핵분열 효모 시스템을 활용하여 황색포도 상구균의 FtsZ와 대장균의 MreB를 표적으로 하는 저분자 억제제의 효과에 대한 반자동 스크리닝 및 정량화를 위해 표준 96웰 플레이트를 사용하는 체계적인 워크플로우를 제안합니다. 여기에서는 각각 FtsZ와 MreB를 특이적으로 표적으로 하는 확립된 억제제인 PC190723 및 A22를 사용하여 반자동 워크플로우를 설정하고 최적화합니다. 이 워크플로우는 전동식 고정밀 스테이지가 장착된 에피형광 현미경을 사용하고 표준 96웰 플레이트에서 자동 이미지 획득을 통해 현재의 표준화를 개선합니다. 따라서 합성 화학 라이브러리의 중간 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있으며 위에 나열된 몇 가지 문제를 피할 수 있습니다.
항생제 내성(AMR)은 전 세계적으로 심각한 건강 위협이며, 새로운 표적을 가진 새로운 항생제가 시급히 필요합니다. 박테리아 세포골격은 TXA709와 같은 세포 분열 단백질 FtsZ의 저분자 억제제와 함께 새로운 항생제 개발을 위한 매력적인 대상으로 부상했으며, 이미 1상 임상시험에서30. FtsZ중합 7,31의 억제제를 확인하기 위해 여러 가지 ?…
The authors have nothing to disclose.
SMP, SR 및 AKS는 원자력학과 국립 과학 교육 및 연구 연구소(National Institute of Science Education and Research)에서 받은 펠로우십을 인정합니다. RS는 원자력부(Department of Atomic Energy)의 교내 자금 지원을 인정하며, 이 작업은 생명공학부(DBT)에서 RS(BT/PR42977/MED/29/1603/2022)에 대한 연구 보조금을 통해 지원됩니다. 저자들은 또한 프로토콜 개발 전반에 걸쳐 V Badireenath Konkimalla의 의견, 제안 및 토론에 대해 감사를 표합니다.
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
96-well plate | Corning | CLS3370 | |
A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
DMSO | Sigma | 317275 | |
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
EDTA | Sigma | EDS-500G | |
epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
Yeast (S. pombe) media | |||
Yeast extract + supplements (YES) | |||
Composition | g/L | ||
Yeast extract | 5 | ||
Dextrose | 30 | ||
Agar | 17 | ||
Adenine | 0.05 | ||
L-Histidine | 0.05 | ||
L-Leucine | 0.05 | ||
L-Lysine HCl | 0.05 | ||
Uracil | 0.05 | ||
Edinburg minimal medium (EMM) | |||
Composition | g/L | concentration | |
potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
KI | 1 | 6.02 mM | |
CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
citric acid | 10 | 47.6 mM | |
Strains/ Plasmids | |||
Strains | Description | Reference | |
CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
Plasmids | |||
pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |