Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano
Summary
A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.
Abstract
Proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, desempenham funções essenciais, como divisão celular e manutenção da forma celular. Além disso, FtsZ e MreB surgiram como alvos importantes para novas descobertas de antimicrobianos. Vários ensaios foram desenvolvidos para identificar compostos direcionados à ligação de nucleotídeos e polimerização dessas proteínas do citoesqueleto, focados principalmente em FtsZ. Além disso, muitos dos ensaios são trabalhosos ou caros, e verificar se essas proteínas são o alvo celular da droga geralmente requer vários métodos. Finalmente, a toxicidade das drogas para as células eucarióticas também representa um problema. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em células de etapa única para descobrir novas moléculas direcionadas ao citoesqueleto bacteriano e minimizar os golpes que podem ser potencialmente tóxicos para as células eucarióticas. A levedura de fissão é passível de peneiras de alto rendimento baseadas em microscopia, e uma peneira visual pode identificar facilmente qualquer molécula que altere a polimerização de FtsZ ou MreB. Nosso ensaio utiliza a placa padrão de 96 poços e depende da capacidade das proteínas bacterianas do citoesqueleto de polimerizar em uma célula eucariótica, como a levedura de fissão. Embora os protocolos descritos aqui sejam para levedura de fissão e utilizem FtsZ de Staphylococcus aureus e MreB de Escherichia coli, eles são facilmente adaptáveis a outras proteínas bacterianas do citoesqueleto que se montam prontamente em polímeros em qualquer hospedeiro de expressão eucariótica. O método aqui descrito deve ajudar a facilitar a descoberta de novos antimicrobianos direcionados às proteínas bacterianas do citoesqueleto.
Introduction
A resistência generalizada a quase todos os antibióticos atualmente empregados para combater infecções bacterianas criou uma necessidade imediata de novas categorias de antibióticos. Um relatório de 2019 indicou que as infecções resistentes a antibióticos resultaram na perda de 1,27 milhão de vidas, contribuindo para uma contagem geral de 4,95 milhões de mortes ao considerar complicações de infecções bacterianas resistentes1. Embora ainda seja eficaz na prática clínica, o arsenal atual de antibióticos visa predominantemente um espectro estreito de processos celulares, concentrando-se principalmente na parede celular, DNA e síntese de proteínas. Ao longo do último meio século, menos de 30 proteínas foram exploradas comercialmente como alvos para o desenvolvimento de novos antibacterianos 2,3. Essa gama limitada de alvos viáveis cria restrições significativas para a descoberta de novos antibióticos ou seus derivados para combater bactérias resistentes a antibióticos. Assim, para superar o problema emergente de resistência aos antibióticos, há a necessidade do desenvolvimento de novos antibióticos com novos alvos e mecanismos de ação.
Idealmente, um alvo antibacteriano deve ser um componente essencial do crescimento celular bacteriano, ser conservado em todas as espécies filogeneticamente diversas, mostrar menos homologia eucariótica e ser acessível a antibióticos4. Desde a descoberta das proteínas bacterianas do citoesqueleto envolvidas na divisão celular e na manutenção da forma celular, elas surgiram como um ponto focal promissor para o desenvolvimento de compostos antibacterianos5. Essas proteínas são essenciais para a viabilidade bacteriana e desempenham um papel fundamental na manutenção da forma celular (MreB, CreS), divisão (FtsZ, FtsA) e segregação de DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), semelhante ao citoesqueleto em células eucarióticas. Notavelmente, FtsZ exibe um nível notavelmente alto de conservação em uma ampla gama de organismos procarióticos, enquanto MreB é encontrado em quase todas as bactérias em forma de bastonete. Essa ampla distribuição e relevância na viabilidade celular tornam essas proteínas um alvo fascinante na pesquisa de antibióticos 5,6,7.
É crucial adotar uma abordagem multifacetada que combine observações in vivo, interações in vitro e experimentos enzimáticos para validar completamente as proteínas do citoesqueleto bacteriano como o alvo primário de um inibidor potencial7. Procedimentos trabalhosos ou implicações substanciais de custo sobrecarregam muitos ensaios disponíveis para esse fim. Esses são obstáculos notáveis para sua utilização generalizada na triagem de compostos de chumbo que podem afetar o citoesqueleto bacteriano. Dentre estes, a microscopia se destaca como um método excepcionalmente eficiente e rápido para avaliar a eficácia dos compostos, examinando diretamente as mudanças na morfologia celular. No entanto, a heteroassociação da proteína-alvo com outros complexos do citoesqueleto, efeitos indiretos devido à ligação fora do alvo e alterações no potencial de membrana, dificuldade em penetrar na célula com eficiência e presença de bombas de efluxo, especialmente em bactérias Gram-negativas, tornam coletivamente complexo identificar a causa precisa da deformação celular bacteriana 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, ou levedura de fissão, como é comumente conhecida, é um organismo eucariótico unicelular em forma de bastonete. A levedura de fissão é amplamente utilizada como organismo modelo em biologia celular e molecular devido à extraordinária conservação em processos celulares, como o ciclo e divisão celular, organização celular e replicação cromossômica com eucariotos superiores, incluindo humanos11,12. Além disso, Errington e colegas expressaram uma proteína citoesquelética bacteriana localizada em pólo DivIVA em levedura de fissão para demonstrar que DivIVA se acumulou em superfícies curvadas negativamente13. Mais uma vez, Balasubramanian e seu grupo estabeleceram pela primeira vez a levedura de fissão como um sistema de modelo celular para trazer novos insights sobre o mecanismo, montagem e dinamicidade da proteína do citoesqueleto de actina de E. coli, como MreB14 e homólogo de tubulina FtsZ15. Eles também demonstram a capacidade do A22 de impedir eficientemente a polimerização do MreB por meio de microscopia de epifluorescência quando expresso em levedura14. Depois disso, outros grupos também empregaram com sucesso leveduras de fissão para estudar as propriedades de montagem das proteínas FtsZ1 e FtsZ2 do cloroplasto16. Mais recentemente, estabelecemos uma prova de conceito da viabilidade do uso de levedura de fissão como uma plataforma celular para rastrear especificamente inibidores do citoesqueleto bacteriano, conduzindo uma avaliação abrangente do impacto de três inibidores de FtsZ conhecidos – proteínas sanguinarina, berberina e PC190723-on FtsZ derivadas de duas bactérias patogênicas, a saber, Staphylococcus aureus e Helicobacter pylori17. Além disso, este ensaio baseado em células de etapa única é fundamental para minimizar o risco de identificação de compostos que podem ser potencialmente tóxicos para células eucarióticas.
Neste relatório, utilizando o sistema de levedura de fissão, propomos um fluxo de trabalho sistemático usando a placa padrão de 96 poços para triagem semiautomatizada e quantificação do efeito de inibidores de pequenas moléculas direcionados a FtsZ de Staphylococcus aureus e MreB de Escherichia coli. Aqui, configuramos e otimizamos o fluxo de trabalho semiautomatizado usando os inibidores estabelecidos PC190723 e A22 que visam especificamente FtsZ e MreB, respectivamente. Este fluxo de trabalho usa um microscópio de epifluorescência equipado com uma platina motorizada de alta precisão e aquisição automatizada de imagens em uma placa padrão de 96 poços para melhorar a padronização atual. Portanto, ele pode ser aplicado a telas de médio e alto rendimento de bibliotecas químicas sintéticas e contorna alguns dos desafios listados acima.
Protocol
Representative Results
Discussion
A resistência antimicrobiana (RAM) é uma séria ameaça à saúde global e há uma necessidade urgente de novos antibióticos com novos alvos. O citoesqueleto bacteriano emergiu como um alvo atraente para o desenvolvimento de novos antibióticos, com inibidores de pequenas moléculas da proteína de divisão celular FtsZ, como TXA709, já em ensaios clínicos de FaseI 30. Vários métodos têm sido desenvolvidos para identificar inibidores da polimerização de FtsZ …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SMP, SR e AKS reconhecem as bolsas recebidas do Instituto Nacional de Educação e Pesquisa Científica, Departamento de Energia Atômica. O RS reconhece o apoio financeiro interno do Departamento de Energia Atômica, e este trabalho é apoiado por meio de uma bolsa de pesquisa para o RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) do Departamento de Biotecnologia (DBT). Os autores também agradecem a V Badireenath Konkimalla por seus comentários, sugestões e discussões ao longo do desenvolvimento do protocolo.
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
Riferimenti
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