La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano
Summary
La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.
Abstract
Las proteínas del citoesqueleto bacteriano, como FtsZ y MreB, realizan funciones esenciales como la división celular y el mantenimiento de la forma celular. Además, FtsZ y MreB se han convertido en objetivos importantes para el descubrimiento de nuevos antimicrobianos. Se han desarrollado varios ensayos para identificar compuestos dirigidos a la unión de nucleótidos y la polimerización de estas proteínas del citoesqueleto, centrándose principalmente en FtsZ. Además, muchos de los ensayos son laboriosos o costosos, y determinar si estas proteínas son el objetivo celular del fármaco a menudo requiere múltiples métodos. Por último, la toxicidad de los fármacos para las células eucariotas también plantea un problema. Aquí, describimos un ensayo basado en células de un solo paso para descubrir nuevas moléculas dirigidas al citoesqueleto bacteriano y minimizar los impactos que podrían ser potencialmente tóxicos para las células eucariotas. La levadura de fisión es susceptible a cribados de alto rendimiento basados en microscopía, y una criba visual puede identificar fácilmente cualquier molécula que altere la polimerización de FtsZ o MreB. Nuestro ensayo utiliza la placa estándar de 96 pocillos y se basa en la capacidad de las proteínas del citoesqueleto bacteriano para polimerizar en una célula eucariota como la levadura de fisión. Si bien los protocolos descritos aquí son para levaduras de fisión y utilizan FtsZ de Staphylococcus aureus y MreB de Escherichia coli, son fácilmente adaptables a otras proteínas del citoesqueleto bacteriano que se ensamblan fácilmente en polímeros en cualquier huésped de expresión eucariota. El método descrito aquí debería ayudar a facilitar el descubrimiento de nuevos antimicrobianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano.
Introduction
La resistencia generalizada a casi todos los antibióticos que se emplean actualmente para combatir las infecciones bacterianas ha creado una necesidad inmediata de nuevas categorías de antibióticos. Un informe de 2019 indicó que las infecciones resistentes a los antibióticos provocaron la pérdida de 1,27 millones de vidas, lo que contribuyó a un recuento total de 4,95 millones de muertes si se consideran las complicaciones de las infecciones bacterianas resistentes1. Aunque sigue siendo eficaz en la práctica clínica, el arsenal actual de antibióticos se dirige principalmente a un espectro estrecho de procesos celulares, centrándose principalmente en la pared celular, el ADN y la síntesis de proteínas. En el último medio siglo, menos de 30 proteínas han sido explotadas comercialmente como dianas para el desarrollo de nuevos antibacterianos 2,3. Esta gama limitada de objetivos viables crea limitaciones significativas para descubrir nuevos antibióticos o sus derivados para combatir las bacterias resistentes a los antibióticos. Por lo tanto, para superar el problema emergente de la resistencia a los antibióticos, es necesario desarrollar nuevos antibióticos con nuevas dianas y mecanismos de acción.
Idealmente, un objetivo antibacteriano debería ser un componente esencial del crecimiento de las células bacterianas, conservarse en todas las especies filogenéticamente diversas, mostrar la menor homología eucariota y ser accesible a losantibióticos. Desde el descubrimiento de las proteínas del citoesqueleto bacteriano implicadas en la división celular y el mantenimiento de la forma celular, se han convertido en un prometedor punto focal para eldesarrollo de compuestos antibacterianos. Estas proteínas son esenciales para la viabilidad bacteriana y desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la forma celular (MreB, CreS), la división (FtsZ, FtsA) y la segregación del ADN (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), similar al citoesqueleto de las células eucariotas. En particular, FtsZ exhibe un nivel notablemente alto de conservación en una amplia gama de organismos procariotas, mientras que MreB se encuentra en casi todas las bacterias en forma de bastoncillo. Esta amplia distribución y relevancia en la viabilidad celular hacen de estas proteínas un objetivo fascinante en la investigación de antibióticos 5,6,7.
Es crucial adoptar un enfoque múltiple que combine observaciones in vivo, interacciones in vitro y experimentos enzimáticos para validar exhaustivamente las proteínas del citoesqueleto bacteriano como el objetivo principal de un inhibidor potencial7. Los procedimientos laboriosos o las implicaciones de costos sustanciales obstaculizan muchos ensayos disponibles para este propósito. Estos son obstáculos notables para su utilización generalizada en el cribado de compuestos principales que podrían afectar al citoesqueleto bacteriano. Entre ellos, la microscopía destaca como un método excepcionalmente eficiente y rápido para evaluar la eficacia de los compuestos mediante el examen directo de los cambios en la morfología celular. Sin embargo, la heteroasociación de la proteína diana con otros complejos de citoesqueletos, los efectos indirectos debidos a la unión fuera del objetivo y los cambios en el potencial de membrana, la dificultad para penetrar en la célula de manera eficiente y la presencia de bombas de eflujo, especialmente en bacterias Gram-negativas, hacen que sea colectivamente complejo identificar la causa precisa de la deformación de las células bacterianas 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, o levadura de fisión como se le conoce comúnmente, es un organismo eucariota unicelular en forma de bastón. La levadura de fisión es ampliamente utilizada como organismo modelo en biología celular y molecular debido a la extraordinaria conservación en procesos celulares como el ciclo celular y la división, la organización celular y la replicación cromosómica con eucariotas superiores, incluyendo humanos11,12. Además, Errington y sus colegas expresaron una proteína del citoesqueleto bacteriano DivIVA localizada en polos en levadura de fisión para demostrar que DivIVA se acumulabaen superficies curvadas negativamente. Una vez más, Balasubramanian y su grupo habían establecido por primera vez la levadura de fisión como un sistema modelo celular para aportar nuevos conocimientos sobre el mecanismo, el ensamblaje y la dinámica de la proteína del citoesqueleto de actina de E. coli como MreB14 y el homólogo de tubulina FtsZ15. También demuestran la capacidad de A22 para impedir de manera eficiente la polimerización de MreB a través de la microscopía de epifluorescencia cuando se expresa en levadura14. A continuación, otros grupos también han empleado con éxito la levadura de fisión para estudiar las propiedades de ensamblaje de las proteínas FtsZ1 y FtsZ2 del cloroplasto16. Más recientemente, hemos establecido una prueba de concepto de la viabilidad del uso de la levadura de fisión como plataforma celular para detectar específicamente inhibidores del citoesqueleto bacteriano mediante la realización de una evaluación exhaustiva del impacto de tres inhibidores conocidos de FtsZ (sanguinarina, berberina y PC190723) en las proteínas FtsZ derivadas de dos bacterias patógenas, a saber, Staphylococcus aureus y Helicobacter pylori17. Además, este ensayo basado en células de un solo paso resulta fundamental para minimizar el riesgo de identificar compuestos que pueden ser potencialmente tóxicos para las células eucariotas.
En este informe, utilizando el sistema de levadura de fisión, proponemos un flujo de trabajo sistemático utilizando la placa estándar de 96 pocillos para el cribado semiautomatizado y la cuantificación del efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a FtsZ de Staphylococcus aureus y MreB de Escherichia coli. Aquí, configuramos y optimizamos el flujo de trabajo semiautomatizado utilizando los inhibidores establecidos PC190723 y A22 que se dirigen específicamente a FtsZ y MreB, respectivamente. Este flujo de trabajo utiliza un microscopio de epifluorescencia equipado con una platina motorizada de alta precisión y adquisición automatizada de imágenes en una placa estándar de 96 pocillos para mejorar la estandarización actual. Por lo tanto, se puede aplicar a pantallas de rendimiento medio y alto de bibliotecas de productos químicos sintéticos y evita algunos de los desafíos enumerados anteriormente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una grave amenaza para la salud mundial, y existe una necesidad urgente de nuevos antibióticos con nuevos objetivos. El citoesqueleto bacteriano se ha convertido en una diana atractiva para el desarrollo de nuevos antibióticos, con inhibidores de moléculas pequeñas de la proteína de división celular FtsZ, como TXA709, que ya se encuentran en ensayos clínicos de faseI 30. Se han desarrollado varios métodos para identificar inhibidores de la poli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SMP, SR y AKS reconocen las becas recibidas del Instituto Nacional de Educación e Investigación Científica, Departamento de Energía Atómica. RS reconoce el apoyo financiero interno del Departamento de Energía Atómica, y este trabajo está respaldado por una subvención de investigación para RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) del Departamento de Biotecnología (DBT). Los autores también agradecen a V Badireenath Konkimalla por sus comentarios, sugerencias y discusiones a lo largo del desarrollo del protocolo.
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
Riferimenti
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