Fissionsjäst som plattform för antibakteriell läkemedelsscreening riktad mot bakteriella cytoskelettproteiner

Summary

Fissionsjäst används här som en heterolog värd för att uttrycka bakteriella cytoskelettproteiner såsom FtsZ och MreB som translationella fusionsproteiner med GFP för att visualisera deras polymerisation. Föreningar som påverkar polymerisationen identifieras också genom avbildning med hjälp av ett fluorescensmikroskop.

Abstract

Bakteriella cytoskelettproteiner som FtsZ och MreB utför viktiga funktioner som celldelning och underhåll av cellform. Vidare har FtsZ och MreB dykt upp som viktiga mål för nya antimikrobiella upptäckter. Flera analyser har utvecklats för att identifiera föreningar som riktar sig mot nukleotidbindning och polymerisation av dessa cytoskelettproteiner, främst med fokus på FtsZ. Dessutom är många av analyserna antingen mödosamma eller kostnadskrävande, och att fastställa om dessa proteiner är det cellulära målet för läkemedlet kräver ofta flera metoder. Slutligen utgör läkemedlens toxicitet för eukaryota celler också ett problem. Här beskriver vi en cellbaserad analys i ett steg för att upptäcka nya molekyler som riktar sig mot bakteriella cytoskelett och minimera träffar som kan vara potentiellt giftiga för eukaryota celler. Fissionsjäst är mottaglig för skärmar med hög genomströmning baserade på mikroskopi, och en visuell skärm kan enkelt identifiera vilken molekyl som helst som förändrar polymerisationen av FtsZ eller MreB. Vår analys använder standardplattan med 96 brunnar och förlitar sig på förmågan hos de bakteriella cytoskelettproteinerna att polymerisera i en eukaryot cell såsom fissionsjästen. Medan protokollen som beskrivs här är för fissionsjäst och använder FtsZ från Staphylococcus aureus och MreB från Escherichia coli, är de lätta att anpassa till andra bakteriella cytoskelettproteiner som lätt samlas till polymerer i alla eukaryota uttrycksvärdar. Metoden som beskrivs här bör bidra till att underlätta ytterligare upptäckt av nya antimikrobiella medel som riktar sig mot bakteriella cytoskelettproteiner.

Introduction

Den utbredda resistensen mot nästan alla antibiotika som för närvarande används för att bekämpa bakteriella infektioner har skapat ett omedelbart behov av nya kategorier av antibiotika. En rapport från 2019 visade att antibiotikaresistenta infektioner ledde till att 1,27 miljoner liv gick förlorade, vilket bidrog till en total siffra på 4,95 miljoner dödsfall när man tar hänsyn till komplikationer från resistenta bakterieinfektioner¹. Även om den nuvarande arsenalen av antibiotika fortfarande är effektiv i klinisk praxis, riktar den sig främst mot ett smalt spektrum av cellulära processer, främst med fokus på cellvägg, DNA och proteinsyntes. Under det senaste halvseklet har färre än 30 proteiner utnyttjats kommersiellt som mål för utveckling av nya antibakteriella medel ^2,3. Detta begränsade utbud av livskraftiga måltavlor skapar betydande hinder för att upptäcka nya antibiotika eller deras derivat för att bekämpa antibiotikaresistenta bakterier. För att komma till rätta med det framväxande problemet med antibiotikaresistens finns det därför ett behov av att utveckla nya antibiotika med nya mål och verkningsmekanismer.

Ett antibakteriellt mål bör helst vara en viktig komponent i bakteriecellernas tillväxt, bevaras i hela den fylogenetiskt olika arten, uppvisa minst eukaryot homologi och vara tillgängligt för antibiotika⁴. Sedan upptäckten av bakteriella cytoskelettproteiner som är involverade i celldelning och upprätthållande av cellform har de framstått som en lovande fokuspunkt för utveckling av antibakteriella föreningar⁵. Dessa proteiner är viktiga för bakteriell livskraft och spelar en avgörande roll för att upprätthålla cellform (MreB, CreS), delning (FtsZ, FtsA) och DNA-segregering (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), liknande cytoskelettet i eukaryota celler. Noterbart är att FtsZ uppvisar en anmärkningsvärt hög bevarandenivå över ett brett spektrum av prokaryota organismer, medan MreB finns i nästan alla stavformade bakterier. En sådan bred distribution och relevans för cellviabilitet gör dessa proteiner till ett fascinerande mål inom antibiotikaforskning ^5,6,7.

Det är avgörande att anta ett mångsidigt tillvägagångssätt som kombinerar in vivo-observationer, in vitro-interaktioner och enzymatiska experiment för att grundligt validera bakteriella cytoskelettproteiner som det primära målet för en potentiell hämmare⁷. Mödosamma procedurer eller betydande kostnadskonsekvenser belastar många tillgängliga analyser för detta ändamål. Dessa är anmärkningsvärda hinder för deras utbredda användning i screening av ledande föreningar som kan påverka det bakteriella cytoskelettet. Bland dessa sticker mikroskopi ut som en exceptionellt effektiv och snabb metod för att bedöma effektiviteten hos föreningar genom att direkt undersöka förändringar i cellmorfologi. Men den hetero-associationen av målprotein med andra cytoskelettkomplex, indirekta effekter på grund av off-target-bindning och förändringar i membranpotential, svårigheter att penetrera cellen effektivt och närvaron av effluxpumpar, särskilt i gramnegativa bakterier, gör det kollektivt komplicerat att fastställa den exakta orsaken till bakteriell celldeformation ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, eller fissionsjäst som den är allmänt känd, är en stavformad encellig eukaryot organism. Fissionsjäst används i stor utsträckning som en modellorganism inom cellulär och molekylärbiologi på grund av det extraordinära bevarandet i cellulära processer såsom cellcykeln och delningen, cellulär organisation och kromosomreplikation med högre eukaryoter, inklusive människor^11,12. Dessutom uttryckte Errington och kollegor ett pollokaliserat bakteriellt cytoskelettprotein DivIVA i fissionsjäst för att visa att DivIVA ackumulerades på negativt krökta ytor¹³. Återigen hade Balasubramanian och hans grupp först etablerat fissionsjäst som ett cellulärt modellsystem för att ge nya insikter om mekanismen, sammansättningen och dynamiken hos E. coli-aktincytoskelettproteinet som MreB¹⁴ och tubulinhomolog FtsZ¹⁵. De visar också förmågan hos A22 att effektivt hindra polymerisationen av MreB genom epifluorescensmikroskopi när den uttrycks i jäst¹⁴. Efter detta har andra grupper också framgångsrikt använt fissionsjäst för att studera sammansättningsegenskaperna hos kloroplastproteinerna FtsZ1 och FtsZ2¹⁶. På senare tid har vi etablerat ett proof-of-concept för genomförbarheten av användningen av fissionsjäst som en cellulär plattform för att specifikt screena för bakteriella cytoskeletthämmare genom att genomföra en omfattande bedömning av effekten av tre kända FtsZ-hämmare – sanguinarin, berberin och PC190723-on FtsZ-proteiner som härrör från två patogena bakterier, nämligen Staphylococcus aureus och Helicobacter pylori¹⁷. Dessutom visar sig denna enstegs cellbaserade analys vara avgörande för att minimera risken för att identifiera föreningar som kan vara potentiellt giftiga för eukaryota celler.

I denna rapport, med hjälp av fissionsjästsystemet, föreslår vi ett systematiskt arbetsflöde med hjälp av standardplattan med 96 brunnar för halvautomatisk screening och kvantifiering av effekten av småmolekylära hämmare riktade mot FtsZ från Staphylococcus aureus och MreB från Escherichia coli. Här sätter vi upp och optimerar det halvautomatiska arbetsflödet med hjälp av de etablerade hämmarna PC190723 och A22 som specifikt riktar sig mot FtsZ respektive MreB. Detta arbetsflöde använder ett epifluorescensmikroskop utrustat med ett motoriserat högprecisionssteg och automatiserad bildinsamling i en standard 96-brunnars platta för att förbättra den nuvarande standardiseringen. Därför kan den tillämpas på skärmar med medelhög och hög genomströmning av syntetiska kemiska bibliotek och kringgår några av de utmaningar som anges ovan.

Protocol

1. Uttryck av GFP-märkta bakteriella cytoskelettproteiner i S. pombe OBS: Se Tabell 1 för information om alla plasmider och stammar som används här. Se tabell 2 för alla mediesammansättningar. Utför kloning av E. coli MreB med en N-terminal GFP-fusion (GFP-MreB) och S. aureus FtsZ som bär en C-terminal GFP (SaFtsZ-GFP) in i S. pombe-expressionsvektorn, pREP42 med en medelstark tiamin-repre…

Representative Results

Uppsättning av plattan med 96 brunnar för screening av läkemedelAnvändning av S. pombe för att uttrycka en C- terminalt GFP märkt S. aureus FtsZ från en vektor (pREP42) som innehåller den medelstarka tiaminrepressibla promotorn nmt41har tidigare fastställts17 och på liknande sätt uttrycktes E. coli MreB märkt med N-terminal GFP också i S. pombe14. Vi har också visat att PC190723, en specifik hä…

Discussion

Antimikrobiell resistens (AMR) är ett allvarligt globalt hälsohot, och det finns ett akut behov av nya antibiotika med nya mål. Det bakteriella cytoskelettet har visat sig vara ett attraktivt mål för att utveckla nya antibiotika, med småmolekylära hämmare av celldelningsproteinet FtsZ, såsom TXA709, redan i kliniska fas I-studier³⁰. Flera metoder har utvecklats för att identifiera hämmare av FtsZ-polymerisation ^7,31. Vi har nyli…

Materials

96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023