Udvikling af en biohybrid myggestikkerbaseret atomkraftmikroskopisonde

Summary

Kvantitative og kontrollerede undersøgelser af insektbidende adfærd er afgørende for at udtænke effektive strategier til bekæmpelse af vektorbårne sygdomme. I denne sammenhæng introduceres en metode til fremstilling af en biohybrid atomkraftmikroskopi (AFM) sonde.

Abstract

Myg, berygtet som de dødeligste dyr for mennesker på grund af deres evne til at overføre sygdomme, udgør en vedvarende udfordring for folkesundheden. Den primære forebyggelsesstrategi, der i øjeblikket er i brug, involverer kemiske afskrækningsmidler, som ofte viser sig ineffektive, da myg hurtigt udvikler resistens. Derfor er opfindelsen af nye forebyggende metoder afgørende. En sådan udvikling afhænger af en grundig forståelse af myggebidende adfærd, hvilket nødvendiggør en eksperimentel opsætning, der nøjagtigt replikerer faktiske bidscenarier med kontrollerbare testparametre og kvantitative målinger. For at bygge bro over dette hul blev en biohybrid atomkraftmikroskopi (AFM) sonde konstrueret med en biologisk stinger – specifikt en myglabrum – som spids. Denne biohybridsonde, der er kompatibel med standard AFM-systemer, muliggør en næsten autentisk simulering af myggeindtrængningsadfærd. Denne metode markerer et skridt fremad i den kvantitative undersøgelse af bidmekanismer, der potentielt kan føre til etablering af effektive barrierer mod vektorbårne sygdomme (VBD’er) og åbne nye veje i kampen mod myggeoverførte sygdomme.

Introduction

Verdenssundhedsorganisationen (WHO) rapporterede, at vektorbårne sygdomme (VBD’er) tegner sig for over 17% af alle smitsomme sygdomme, som forårsager mere end 7,00,000 dødsfald om året globalt. For eksempel, som det dødeligste dyr i verden, spredte myg adskillige patogener, såsom denguefeber, malaria og Zika, gennem blodfodrende leddyr, hvilket resulterede i 700 millioner infektioner hvert år¹. Udforskninger mod udvikling af effektive foranstaltninger til forebyggelse af VBD’er er af afgørende betydning, herunder efterligning af myggenes penetrationsadfærd for at undersøge deres bidmekanismer og undersøgelser af potentielle barrierer for at bevise deres effektivitet til forebyggelse af penetration. En central udfordring er at udvikle passende tilgange til at udføre sådanne undersøgelser. Der er gjort en indsats i litteraturen, herunder udvikling af mikroskala nåle, der ligner geometrien af en myg stinger; Imidlertid har mange af de materialer, der bruges til at fremstille disse mikronåle (dvs. viskoelastiske materialer², silicium (Si), glas, keramik³ osv.), Forskellige mekaniske egenskaber end det biologiske materiale i myggens snabel. De konstruerede materialer kan være sprøde og tilbøjelige til brud og bukke ^3,4, mens myggens proboscis kan modstå brud eller bukke bedre⁴. Fordelen ved at have en biohybridsonde ved hjælp af en mygs labrum i stedet for konstruerede materialer er, at det kan være en mere nøjagtig repræsentation af myggenes piercingmekanisme. Specialiserede værktøjer skal også integreres med mikronåle for at udføre kvantitative undersøgelser, såsom nøjagtig måling af kraft⁵, hvilket ikke let kan opnås med tilpassede opsætninger ved hjælp af konstruerede mikronåle.

Atomic force mikroskopi (AFM) -baseret tilgang er lovende, fordi den fungerer ved at anvende en cantilever med en ultrafin spids, der er omhyggeligt placeret tæt på en prøves overflade. Spidsen kan enten scanne på tværs eller presses mod / ind i en overflade og opleve varierende attraktive eller frastødende kræfter på grund af dens interaktioner med en prøve⁶. Disse interaktioner fører til udkragningens afbøjning, som spores ved refleksion af en laserstråle fra cantileverens top på en fotodetektor⁶. Systemets ekstraordinære følsomhed over for bevægelse gør det muligt for AFM at udføre en bred vifte af målinger, herunder, men ikke begrænset til, morfologisk kortlægning med picometernøjagtighed, kraftmålinger fra piconewton til mikronewton og omfattende multifysiske undersøgelser⁷. For eksempel kan AFM-fordybninger udføres for nøjagtigt at vurdere responsen på den påførte kraft af en prøve og også for at måle hårdheden, elasticiteten og andre mekaniske egenskaber af en prøve ved kobling med passende analytiske modeller⁸. Sonden af AFM er oftest lavet af silicium (Si) eller siliciumnitrid (Si₃N₄)⁸ med en længde på 20-300 μm⁹ og en spidsradius i størrelsesordenen flere til titalls nanometer¹⁰. Spidsradius på nanometerskala kan være ideel til applikationer såsom billeddannelse i høj opløsning; Det har dog ikke karakteristika for biologiske stingers til undersøgelser, der forsøger at efterligne penetrationsadfærd med hensyn til stivhed, radius, form og billedformat. For eksempel er mikronålstrukturen af en myg fascicle, som har et billedformat på ~ 60¹¹ (længde ~ 1,5 mm til 2 mm; diameter ~ 30 μm)¹². Mens en konventionel AFM-sonde kan antages at ligne en biologisk stinger som en labrum, vil dens forskellige materialeegenskaber og dimensioner ikke afspejle den virkelige situation under et bid.

For at muliggøre kvantitative undersøgelser af penetrationsadfærd, der efterligner biologiske bid af insekter eller andre dyr med stikkere, udvikles her en proces til fremstilling af biohybride AFM-udkragninger med en biologisk stinger som spids. Som et casestudie blev en AFM-udkragning med en myglabrums spids fastgjort med succes demonstreret. Ved at udnytte eksisterende oplysninger fra litteraturen om de typiske indsættelseskræfter, som en myg bruger til at gennembore gennem et offers hud^12,13, kan denne biohybride AFM-udkragning potentielt tillade næsten ægte efterligning af myggestik under en almindelig AFM. Protokollen om udnyttelse af mikrobiologiske stingere til fremstilling af biohybride AFM-udkragninger kan også anvendes til udvikling af andre skarpe stingerbaserede biohybride AFM-udkragninger til kvantitative undersøgelser af en række bidmekanismer.

Terminologier
Et skema over en proboscis og dens komponenter af interesse er vist i figur 1, og deres definitioner er (1) Proboscis: en kropsdel fra munden af en myg, der gør det muligt for myggen at fodre sig selv, med en kerneskalstruktur sammensat af fascicle (kerne) og labium (skal), (2) Labium: det mørke og stumpe ydre dække af en proboscis², (3) Fascicle: en gruppe slanke nåle indeholdt inde i labium, herunder to maxillae, to mandibler, en hypopharynx og en labrum², (4) Hypopharynx: ansvarlig for udskillelse af spyt i værtens blodbanen², (5) Maxillae: savtakket medlem, der hjælper med fodringsmekanismen², (5) Mandibles: ligner maxillaen, de hjælper myggen i fodringsmekanismen og har en skarp spids², (6) Labrum: hovedelementet til at trænge ind i et offers hud, som er meget større end maxillae, mandibles og hypopharynx. Det har også sensoriske strukturer, der gør det muligt at finde blodkar og indre kanaler under huden², (7) Manipulator: en samling med tre frihedsgrader og mikronskalanøjagtighed til positionering, hvilket tillader bevægelse i XYZ-retninger, (8) Klemmesamling: en specialfremstillet 2-delt klemme monteret på manipulatoren, der bruges til at klemme den spidsløse AFM-udkragning under eksperimentet.

Protocol

Den myggeart, der anvendes til denne protokol, er en uinficeret voksen hun Aedes aegypti (A. aegypti), modtaget frosset og opbevaret i en -20 ° C grad fryser. Arten blev leveret af NIH / NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center til distribution gennem BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. De reagenser og det udstyr, der anvendes til undersøgelsen, er anført i materialetabellen. <…

Representative Results

Scanningselektronmikroskopi (SEM) billeder af den fremstillede bio-hybrid AFM sonde kan findes i figur 7. Enden af labrum blev med succes limet til den spidsløse cantileverbjælke. På grund af myggens naturlige krumning og den manuelle betjening af den præsenterede protokol er det ekstremt vanskeligt at opnå en cantilever med en stingerspids perfekt vinkelret på cantileveren. Den off-center vinkel mellem stinger og en imaginær centerlinje vinkelret på cantilever er normalt ~ 10 grader…

Discussion

Trin 1 i protokollen er beregnet til at rense den biologiske prøve for det uønskede labium. For at opnå dette foretages et snit på labium, men ikke på fascicle, som hviler direkte under labium (figur 1). Fordi fascicle og labium ikke er sammenføjet ved deres grænseflade (dvs. labium er fri til at glide langs fascicle og holdes kun på plads ved dets fastgørelse til myghovedet), er det udførte snit beregnet til at adskille en del af labium fra myggens hoved, hvilket letter fjernelsen…

Materials

5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Larghezza: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.