Het protocol maakt gebruik van geavanceerde light-sheet microscopie samen met aangepaste methoden voor het opruimen van weefsel om ingewikkelde hartstructuren in knaagdierharten te onderzoeken, met een groot potentieel voor het begrijpen van cardiale morfogenese en remodellering.
Light-sheet microscopie (LSM) speelt een cruciale rol bij het begrijpen van de ingewikkelde driedimensionale (3D) structuur van het hart en biedt cruciale inzichten in fundamentele hartfysiologie en pathologische reacties. Hierbij verdiepen we ons in de ontwikkeling en implementatie van de LSM-techniek om de micro-architectuur van het hart in muismodellen op te helderen. De methodologie integreert een op maat gemaakt LSM-systeem met technieken voor het opruimen van weefsel, waardoor lichtverstrooiing in hartweefsel wordt verminderd voor volumetrische beeldvorming. De combinatie van conventionele LSM met beeldstitching en multiview-deconvolutiebenaderingen maakt het mogelijk om het hele hart vast te leggen. Om de inherente afweging tussen axiale resolutie en gezichtsveld (FOV) aan te pakken, introduceren we verder een axiaal geveegde lichtbladmicroscopie (ASLM)-methode om onscherp licht te minimaliseren en het hart gelijkmatig te verlichten in de voortplantingsrichting. Ondertussen verbeteren weefselopruimingsmethoden zoals iDISCO de lichtpenetratie, vergemakkelijken ze de visualisatie van diepe structuren en zorgen ze voor een uitgebreid onderzoek van het myocardium door het hele hart. De combinatie van de voorgestelde LSM en methoden voor het opruimen van weefsel biedt een veelbelovend platform voor onderzoekers bij het oplossen van hartstructuren in knaagdierharten, met een groot potentieel voor het begrip van cardiale morfogenese en remodellering.
Hartfalen blijft wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak, voornamelijk als gevolg van het gebrek aan regeneratief vermogen van rijpe cardiomyocyten. De ingewikkelde architectuur van het hart speelt een cruciale rol in zijn functie en geeft inzicht in ontwikkelingsprocessen. Een diepgaand begrip van de cardiale structuur is essentieel voor het ophelderen van de fundamentele processen van cardiale morfogenese en remodellering als reactie op een hartinfarct. Recente vooruitgang heeft aangetoond dat neonatale muizen de hartfunctie kunnen herstellen na een verwonding, terwijl volwassen muizen een dergelijk regeneratief vermogen missen. Dit legt een basis voor het onderzoeken van signalen die verband houden met structurele en functionele afwijkingen in muismodellen. Traditionele beeldvormingsmethoden, zoals confocale microscopie, hebben technische beperkingen, waaronder beperkte penetratiediepte, traag puntscanschema en fotoschade door langdurige blootstelling aan laserlicht. Deze belemmeren een uitgebreide driedimensionale (3D) beeldvorming van het intacte hart. In deze context komt light-sheet microscopie (LSM) naar voren als een krachtige oplossing, die de voordelen biedt van high-speed beeldvorming, verminderde fotoschade en uitzonderlijke optische sectiemogelijkheden 3,4,5. De unieke eigenschappen van LSM maken het tot een veelbelovende methode om de beperkingen van conventionele technieken te overwinnen en ongekende inzichten te bieden in cardiale ontwikkeling en remodelleringsprocessen 6,7,8.
In dit protocol introduceren we een beeldvormingsstrategie die geavanceerde LSM combineert met aangepaste weefselopruimingsbenaderingen9, waardoor volledige muizenharten kunnen worden afgebeeld zonder de noodzaak van specifieke etikettering en mechanische sectie. We stellen verder voor dat conventionele LSM-beeldvorming kan worden verbeterd door middel van multiview deconvolutie10 of axiaal geveegde lichtbladmicroscopie (ASLM) technieken 11,12,13,14,15 om de axiale resolutie te verbeteren. Bovendien kan de integratie van beeldstitching met een van deze methoden de afweging tussen ruimtelijke resolutie en gezichtsveld (FOV) effectief overwinnen, waardoor de beeldvorming van volwassen muizenharten wordt bevorderd. De integratie van talrijke benaderingen voor weefselopruiming, waaronder hydrofobe, hydrofiele en op hydrogel gebaseerde methoden, maakt een diepere lichtpenetratie mogelijk voor het vastleggen van de morfologie van het hele hart 16,17,18,19.
Hoewel meerdere opruimmethoden compatibel zijn met de huidige LSM-systemen, is het doel om fotonverstrooiing te minimaliseren en de lichtpenetratie in weefsels, zoals het hart, te verbeteren door lipiden te vervangen door een medium dat nauw aansluit bij de brekingsindex. iDISCO werd gekozen als de representatieve20,21 en aangepast voor autofluorescentiebeeldvorming in dit protocol vanwege de snelle verwerking en hoge transparantie (Figuur 1A). Gezamenlijk biedt de integratie van de geavanceerde LSM-benadering met weefselopruimingstechnieken een veelbelovend kader om ingewikkelde cardiale anatomie in knaagdierharten te ontrafelen, met een aanzienlijk potentieel voor het vergroten van ons begrip van cardiale morfogenese en pathogenese.
De vooruitgang van beeldvormings-, berekenings- en weefselopruimingsmethoden heeft een ongeëvenaarde kans geboden om de hartstructuur en -functie uitgebreid te onderzoeken. Dit heeft een groot potentieel voor het verdiepen van ons begrip van cardiale morfogenese en pathogenese met behulp van een intact knaagdierhartmodel. In tegenstelling tot in vivo studies van het hart van zebravissen met een vergelijkbare benadering 40,41,42,43<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
We spreken onze dank uit aan de groep van Dr. Eric Olson in het UT Southwestern Medical Center voor het genereus delen van de diermodellen. We waarderen alle constructieve opmerkingen van D-incubator-leden van UT Dallas. Dit werk werd ondersteund door NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) en UT Dallas STARS-programma (Y.D.).
1% Agarose | |||
Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | – | – | |
Chemicals for tissue clearing | |||
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Software and algorithms | |||
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
Key components of the customized light-sheet system | |||
0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
Filter | Chroma | ET525/30 | |
Filter | Chroma | ET585-40 | |
Filter | Chroma | ET645-75 | |
Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Stepper motor | Pololu | 1474 | |
Tube lens | Olympus | MVX-TLU |