लाइट-शीट इमेजिंग कृंतक दिलों में हृदय संरचना को प्रकट करने के लिए
Summary
प्रोटोकॉल कृंतक दिलों में जटिल हृदय संरचनाओं की जांच करने के लिए अनुकूलित ऊतक समाशोधन विधियों के साथ उन्नत प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है, हृदय आकृति विज्ञान और रीमॉडेलिंग की समझ के लिए बड़ी क्षमता रखता है।
Abstract
लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएम) हृदय की जटिल त्रि-आयामी (3 डी) संरचना को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो मौलिक हृदय शरीर विज्ञान और पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हम इसके द्वारा माउस मॉडल में दिल के सूक्ष्म वास्तुकला को स्पष्ट करने के लिए एलएसएम तकनीक के विकास और कार्यान्वयन में तल्लीन करते हैं। कार्यप्रणाली ऊतक समाशोधन तकनीकों के साथ एक अनुकूलित एलएसएम प्रणाली को एकीकृत करती है, जो वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के लिए हृदय के ऊतकों के भीतर प्रकाश प्रकीर्णन को कम करती है। छवि सिलाई और मल्टीव्यू डिकॉन्वोल्यूशन दृष्टिकोण के साथ पारंपरिक एलएसएम का संयोजन पूरे दिल पर कब्जा करने की अनुमति देता है। अक्षीय संकल्प और देखने के क्षेत्र (एफओवी) के बीच निहित व्यापार बंद को संबोधित करने के लिए, हम आगे एक अक्षीय रूप से बह प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी (एएसएलएम) विधि बाहर फोकस प्रकाश को कम करने और समान रूप से प्रसार दिशा भर में दिल रोशन शुरू करते हैं. इस बीच, iDISCO जैसे ऊतक समाशोधन विधियां प्रकाश प्रवेश को बढ़ाती हैं, गहरी संरचनाओं के दृश्य की सुविधा प्रदान करती हैं और पूरे हृदय में मायोकार्डियम की व्यापक परीक्षा सुनिश्चित करती हैं। प्रस्तावित एलएसएम और ऊतक समाशोधन विधियों का संयोजन कृंतक दिलों में हृदय संरचनाओं को हल करने में शोधकर्ताओं के लिए एक आशाजनक मंच प्रस्तुत करता है, जिसमें कार्डियक मॉर्फोजेनेसिस और रीमॉडेलिंग की समझ के लिए काफी संभावनाएं हैं।
Introduction
दिल की विफलता दुनिया भर में मृत्यु दर का प्रमुख कारण बनी हुई है, मुख्य रूप से परिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स1 की पुनर्योजी क्षमता की कमी के कारण। हृदय की जटिल वास्तुकला इसके कार्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है और विकास प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। हृदय संरचना की गहन समझ हृदय आकृति विज्ञान की मूलभूत प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने और मायोकार्डियल रोधगलन के जवाब में रीमॉडेलिंग के लिए आवश्यक है। हाल की प्रगति से पता चला है कि नवजात चूहों चोट के बाद हृदय समारोह बहाल कर सकते हैं, जबकि वयस्क चूहों ऐसी पुनर्योजी क्षमता2 की कमी. यह माउस मॉडल में संरचनात्मक और कार्यात्मक असामान्यताओं के साथ जुड़े संकेतों की जांच के लिए एक नींव स्थापित करता है. पारंपरिक इमेजिंग विधियों, जैसे कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, में तकनीकी सीमाएं हैं, जिनमें प्रतिबंधित प्रवेश गहराई, धीमी बिंदु-स्कैनिंग योजना और लेजर प्रकाश के लंबे समय तक संपर्क से फोटो क्षति शामिल है। ये अक्षुण्ण हृदय की व्यापक त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग में बाधा डालते हैं। इस संदर्भ में, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी (LSM) उच्च गति इमेजिंग, कम फोटो क्षति, और असाधारण ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमताओं 3,4,5 के फायदे की पेशकश एक शक्तिशाली समाधान के रूप में उभरता है. एलएसएम की अनूठी विशेषताएं इसे पारंपरिक तकनीकों की सीमाओं को दूर करने के लिए एक आशाजनक विधि के रूप में स्थान देती हैं, हृदय विकास और रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं 6,7,8में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक इमेजिंग रणनीति है कि अनुकूलित ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण9 के साथ उन्नत एलएसएम को जोड़ती है, विशिष्ट लेबलिंग और यांत्रिक सेक्शनिंग के लिए आवश्यकता के बिना पूरे माउस दिल की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है परिचय देते हैं. हम आगे प्रस्ताव करते हैं कि अक्षीय संकल्प में सुधार के लिए पारंपरिक एलएसएम इमेजिंग को मल्टीव्यू डिकोनवल्शन 10 या अक्षीय रूप से बहने वाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एएसएलएम) तकनीकों11,12,13,14,15 के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों में से किसी के साथ छवि सिलाई का एकीकरण स्थानिक संकल्प और देखने के क्षेत्र (एफओवी) के बीच व्यापार-बंद को प्रभावी ढंग से दूर कर सकता है, जिससे वयस्क माउस दिलों की इमेजिंग को आगे बढ़ाया जा सकता है। हाइड्रोफोबिक, हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोजेल-आधारित तरीकों सहित कई ऊतक समाशोधन दृष्टिकोणों का समावेश, पूरे दिल 16,17,18,19की आकृति विज्ञान को पकड़ने के लिए गहरी प्रकाश पैठ को सक्षम बनाता है।
जबकि कई समाशोधन विधियां वर्तमान एलएसएम प्रणालियों के साथ संगत हैं, लक्ष्य फोटॉन बिखरने को कम करना और हृदय की तरह ऊतकों में प्रकाश प्रवेश को बढ़ाना है, लिपिड को एक माध्यम के साथ बदलकर जो इसके अपवर्तक सूचकांक से निकटता से मेल खाता है। आईडीआईएससीओ को प्रतिनिधि20,21 के रूप में चुना गया था और इसकी तेजी से प्रसंस्करण और उच्च पारदर्शिता(चित्रा 1ए)के कारण इस प्रोटोकॉल में ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया था। सामूहिक रूप से, ऊतक समाशोधन तकनीकों के साथ उन्नत एलएसएम दृष्टिकोण का एकीकरण कृंतक दिलों में जटिल कार्डियक शरीर रचना को उजागर करने के लिए एक आशाजनक ढांचा प्रदान करता है, जिसमें कार्डियक मॉर्फोजेनेसिस और रोगजनन की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इमेजिंग, गणना और ऊतक समाशोधन विधियों की प्रगति ने हृदय संरचना और कार्य की बड़े पैमाने पर जांच करने का एक अनूठा अवसर प्रदान किया है। यह एक अक्षुण्ण कृंतक हृदय मॉडल का उपयोग करके कार्डियक मॉर्फोजेनेसिस ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पशु मॉडल को उदारतापूर्वक साझा करने के लिए यूटी साउथवेस्टर्न मेडिकल सेंटर में डॉ एरिक ओल्सन के समूह के प्रति आभार व्यक्त करते हैं। हम यूटी डलास में डी-इनक्यूबेटर सदस्यों द्वारा प्रदान की गई सभी रचनात्मक टिप्पणियों की सराहना करते हैं। इस काम को एनआईएच R00HL148493 (वाईडी), R01HL162635 (वाईडी), और यूटी डलास स्टार्स प्रोग्राम (वाईडी) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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