Protokollen benytter avansert lysarkmikroskopi sammen med tilpassede vevsryddingsmetoder for å undersøke intrikate hjertestrukturer i gnagerhjerter, med stort potensial for forståelse av hjertemorfogenese og remodellering.
Lysarkmikroskopi (LSM) spiller en sentral rolle i å forstå den intrikate tredimensjonale (3D) strukturen i hjertet, og gir avgjørende innsikt i grunnleggende hjertefysiologi og patologiske responser. Vi dykker herved inn i utviklingen og implementeringen av LSM-teknikken for å belyse hjertets mikroarkitektur i musemodeller. Metodikken integrerer et tilpasset LSM-system med vevsryddingsteknikker, og reduserer lysspredning i hjertevev for volumetrisk avbildning. Kombinasjonen av konvensjonell LSM med bildesøm og multiview deconvolution tilnærminger gjør det mulig å fange hele hjertet. For å adressere den iboende avveiningen mellom aksial oppløsning og synsfelt (FOV), introduserer vi videre en aksialt feid lysarkmikroskopi (ASLM) -metode for å minimere ufokusert lys og jevnt belyse hjertet over forplantningsretningen. I mellomtiden forbedrer vevsryddingsmetoder som iDISCO lyspenetrasjon, letter visualiseringen av dype strukturer og sikrer en omfattende undersøkelse av myokardiet gjennom hele hjertet. Kombinasjonen av de foreslåtte LSM- og vevsryddingsmetodene presenterer en lovende plattform for forskere i å løse hjertestrukturer i gnagerhjerter, og har stort potensial for forståelse av hjertemorfogenese og remodellering.
Hjertesvikt er fortsatt den ledende årsaken til dødelighet over hele verden, hovedsakelig på grunn av mangel på regenerativ kapasitet av modne kardiomyocytter1. Den intrikate arkitekturen i hjertet spiller en avgjørende rolle i sin funksjon og gir innsikt i utviklingsprosesser. En dyp forståelse av hjertestruktur er avgjørende for å belyse de grunnleggende prosessene for hjertemorfogenese og remodellering som respons på hjerteinfarkt. Nylige fremskritt har vist at nyfødte mus kan gjenopprette hjertefunksjonen etter skade, mens voksne mus mangler slik regenerativ kapasitet2. Dette etablerer et grunnlag for å undersøke signaler knyttet til strukturelle og funksjonelle abnormiteter i musemodeller. Tradisjonelle bildebehandlingsmetoder, som konfokalmikroskopi, har tekniske begrensninger, inkludert begrenset penetrasjonsdybde, langsom punktskanning og fotoskade fra langvarig eksponering for laserlys. Disse hindrer omfattende tredimensjonal (3D) avbildning av det intakte hjertet. I denne sammenheng fremstår lysarkmikroskopi (LSM) som en kraftig løsning, og tilbyr fordelene med høyhastighetsbilder, redusert fotoskade og eksepsjonelle optiske seksjoneringsevner 3,4,5. De unike egenskapene til LSM posisjonerer det som en lovende metode for å overvinne begrensningene i konvensjonelle teknikker, og gir enestående innsikt i hjerteutvikling og ombyggingsprosesser 6,7,8.
I denne protokollen introduserer vi en avbildningsstrategi som kombinerer avansert LSM med tilpassede vevsryddingsmetoder9, noe som muliggjør avbildning av hele musehjerter uten behov for spesifikk merking og mekanisk seksjonering. Vi foreslår videre at konvensjonell LSM-avbildning kan forbedres gjennom multiview deconvolution10 eller aksialt feid lysarkmikroskopi (ASLM) teknikker 11,12,13,14,15 for å forbedre aksial oppløsning. I tillegg kan integrering av bildesøm med en av disse metodene effektivt overvinne avveiningen mellom romlig oppløsning og synsfelt (FOV), og dermed fremme avbildningen av voksne musehjerter. Inkorporering av mange vevsryddingsmetoder, inkludert hydrofobe, hydrofile og hydrogelbaserte metoder, muliggjør dypere lyspenetrasjon for å fange morfologien til hele hjertet 16,17,18,19.
Mens flere ryddemetoder er kompatible med dagens LSM-systemer, er målet å minimere fotonspredning og forbedre lyspenetrasjonen i vev, som hjertet, ved å erstatte lipider med et medium som nøye samsvarer med brytningsindeksen. iDISCO ble valgt som representant20,21 og tilpasset autofluorescensavbildning i denne protokollen på grunn av rask behandling og høy gjennomsiktighet (figur 1A). Samlet gir integreringen av den avanserte LSM-tilnærmingen med vevsryddingsteknikker et lovende rammeverk for å avdekke intrikat hjerteanatomi i gnagerhjerter, og har et betydelig potensial for å fremme vår forståelse av hjertemorfogenese og patogenese.
Utviklingen av bildebehandling, beregning og vevsryddingsmetoder har gitt en enestående mulighet til å undersøke hjertestruktur og funksjon i stor grad. Dette har et stort potensial for å utdype vår forståelse av hjertemorfogenese og patogenese ved hjelp av en intakt gnagerhjertemodell. I motsetning til in vivo-studier av sebrafiskhjerte med en lignende tilnærming 40,41,42,43, gjør integreringen av avanserte LSM-teknikker og vevsryddingsmetoder oss i stand til å overvinne utfordringer mellom romlig oppl…
The authors have nothing to disclose.
Vi uttrykker vår takknemlighet til Dr. Eric Olsons gruppe ved UT Southwestern Medical Center for sjenerøst å dele dyremodellene. Vi setter pris på alle konstruktive kommentarer fra D-inkubator medlemmer på UT Dallas. Dette arbeidet ble støttet av NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) og UT Dallas STARS-programmet (YD).
1% Agarose | |||
Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | – | – | |
Chemicals for tissue clearing | |||
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Software and algorithms | |||
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
Key components of the customized light-sheet system | |||
0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
Filter | Chroma | ET525/30 | |
Filter | Chroma | ET585-40 | |
Filter | Chroma | ET645-75 | |
Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Stepper motor | Pololu | 1474 | |
Tube lens | Olympus | MVX-TLU |