L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs
Summary
Le protocole utilise la microscopie à feuillet de lumière avancée ainsi que des méthodes de nettoyage tissulaire adaptées pour étudier les structures cardiaques complexes dans les cœurs de rongeurs, ce qui présente un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.
Abstract
La microscopie à feuillet de lumière (LSM) joue un rôle central dans la compréhension de la structure tridimensionnelle complexe (3D) du cœur, fournissant des informations cruciales sur la physiologie cardiaque fondamentale et les réponses pathologiques. Nous nous penchons ici sur le développement et la mise en œuvre de la technique LSM pour élucider la micro-architecture du cœur dans des modèles murins. La méthodologie intègre un système LSM personnalisé avec des techniques de nettoyage des tissus, atténuant la diffusion de la lumière dans les tissus cardiaques pour l’imagerie volumétrique. La combinaison d’un LSM conventionnel avec des approches d’assemblage d’images et de déconvolution multivues permet de capturer l’ensemble du cœur. Pour résoudre le compromis inhérent entre la résolution axiale et le champ de vision (FOV), nous introduisons une méthode de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) pour minimiser la lumière floue et éclairer uniformément le cœur dans le sens de la propagation. Entre-temps, les méthodes de nettoyage des tissus telles que iDISCO améliorent la pénétration de la lumière, facilitant la visualisation des structures profondes et assurant un examen complet du myocarde dans l’ensemble du cœur. La combinaison du LSM proposé et des méthodes de nettoyage des tissus présente une plate-forme prometteuse pour les chercheurs dans la résolution des structures cardiaques dans les cœurs de rongeurs, avec un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.
Introduction
L’insuffisance cardiaque reste la principale cause de mortalité dans le monde, principalement en raison du manque de capacité de régénération des cardiomyocytes matures1. L’architecture complexe du cœur joue un rôle crucial dans sa fonction et donne un aperçu des processus de développement. Une compréhension approfondie de la structure cardiaque est essentielle pour élucider les processus fondamentaux de la morphogenèse et du remodelage cardiaques en réponse à l’infarctus du myocarde. Des progrès récents ont démontré que les souris néonatales peuvent restaurer la fonction cardiaque après une blessure, alors que les souris adultes n’ont pas une telle capacité de régénération2. Cela établit une base pour l’étude des indices associés aux anomalies structurelles et fonctionnelles dans les modèles murins. Les méthodes d’imagerie traditionnelles, telles que la microscopie confocale, présentent des limites techniques, notamment une profondeur de pénétration limitée, un schéma de balayage ponctuel lent et des dommages photographiques dus à une exposition prolongée à la lumière laser. Ceux-ci entravent l’imagerie tridimensionnelle (3D) complète du cœur intact. Dans ce contexte, la microscopie à feuillet de lumière (LSM) apparaît comme une solution puissante, offrant les avantages d’une imagerie à grande vitesse, d’une réduction des dommages photographiques et de capacités exceptionnelles de sectionnement optique 3,4,5. Les caractéristiques uniques de la LSM en font une méthode prometteuse pour surmonter les limites des techniques conventionnelles, fournissant des informations sans précédent sur les processus de développement et de remodelage cardiaques 6,7,8.
Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie d’imagerie qui combine une LSM avancée avec des approches de clarification tissulaire adaptées9, permettant l’imagerie de cœurs de souris entiers sans avoir besoin d’un marquage spécifique et d’une section mécanique. Nous proposons en outre que l’imagerie LSM conventionnelle puisse être améliorée par des techniques de déconvolutionmultivue 10 ou de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) 11,12,13,14,15 pour améliorer la résolution axiale. De plus, l’intégration de l’assemblage d’images avec l’une ou l’autre de ces méthodes peut surmonter efficacement le compromis entre la résolution spatiale et le champ de vision (FOV), faisant ainsi progresser l’imagerie des cœurs de souris adultes. L’incorporation de nombreuses approches de nettoyage des tissus, y compris les méthodes hydrophobes, hydrophiles et à base d’hydrogel, permet une pénétration plus profonde de la lumière pour capturer la morphologie de l’ensemble du cœur 16,17,18,19.
Bien que plusieurs méthodes de clarification soient compatibles avec les systèmes LSM actuels, l’objectif est de minimiser la diffusion des photons et d’améliorer la pénétration de la lumière dans les tissus, comme le cœur, en remplaçant les lipides par un milieu qui correspond étroitement à son indice de réfraction. iDISCO a été choisi comme représentant20,21 et adapté à l’imagerie par autofluorescence dans ce protocole en raison de son traitement rapide et de sa grande transparence (Figure 1A). Collectivement, l’intégration de l’approche LSM avancée avec des techniques de nettoyage des tissus offre un cadre prometteur pour démêler l’anatomie cardiaque complexe dans les cœurs de rongeurs, avec un potentiel important pour faire progresser notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès de l’imagerie, du calcul et des méthodes d’élimination des tissus ont fourni une occasion sans précédent d’étudier en profondeur la structure et la fonction cardiaques. Cela présente un grand potentiel pour approfondir notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques à l’aide d’un modèle de cœur de rongeur intact. Contrairement aux études in vivo du cœur de poisson-zèbre utilisant une approche similaire 40,41,42,43, l’intégration de techniques LSM av…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous exprimons notre gratitude au groupe du Dr Eric Olson du UT Southwestern Medical Center pour avoir généreusement partagé les modèles animaux. Nous apprécions tous les commentaires constructifs fournis par les membres de D-incubator à UT Dallas. Ce travail a été soutenu par le programme NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) et UT Dallas STARS (Y.D.).
Materials
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | – | – | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 – 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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