La biologia del tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è in gran parte inesplorata a causa della limitata accessibilità del tessuto umano. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei per identificare la composizione cellulare di questo deposito adiposo unico.
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Articolo metodologico
Isolamento di nuclei dal tessuto adiposo intermuscolare umano e sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo a valle
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è un deposito adiposo relativamente poco studiato situato tra le fibre muscolari. Il contenuto di IMAT aumenta con l'età e l'IMC ed è associato a malattie metaboliche e muscolo-degenerative; tuttavia, una comprensione delle proprietà biologiche dell'IMAT e della sua interazione con le fibre muscolari circostanti è gravemente carente. Negli ultimi anni, il sequenziamento dell'RNA di singole cellule e nuclei ci ha fornito atlanti specifici per tipo di cellula di diversi tessuti umani. Tuttavia, la composizione cellulare dell'IMAT umano rimane in gran parte inesplorata a causa delle sfide intrinseche della sua accessibilità dalla raccolta della biopsia nell'uomo. Oltre alla quantità limitata di tessuto raccolto, l'elaborazione dell'IMAT umano è complicata a causa della sua vicinanza al tessuto muscolare scheletrico e alla fascia. La natura lipidica degli adipociti lo rende incompatibile con l'isolamento a singola cellula. Pertanto, il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo è ottimale per ottenere trascrittomica ad alta dimensionalità con risoluzione di singola cellula e fornisce il potenziale per scoprire la biologia di questo deposito, inclusa l'esatta composizione cellulare di IMAT. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei. Questo protocollo consente la profilazione di migliaia di nuclei utilizzando un approccio basato su goccioline, fornendo così la capacità di rilevare tipi di cellule rare e poco abbondanti.
Introduzione
Il tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è un deposito adiposo ectopico che risiede tra e intorno alle fibre muscolari1. Come descritto in dettaglio in una recente revisione di Goodpaster et al., l'IMAT può essere rilevato utilizzando la tomografia computerizzata (TC) ad alta risoluzione e la risonanza magnetica (MRI) (Figura 1A, B) e si trova intorno e all'interno delle fibre muscolari in tutto il corpo1. La quantità di IMAT varia notevolmente da individuo a individuo ed è influenzata da BMI, età, sesso, razza e sedentarietà 2,3,4
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Protocollo
Il campione utilizzato per questo protocollo faceva parte dello Studio sui muscoli, la mobilità e l'invecchiamento (SOMMA)15, che è stato approvato dal Western IRB-Copernicus Group (WCG) Institutional Review Board ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto per la loro partecipazione allo studio.
NOTA : Questo protocollo è adattato da un protocollo precedente che utilizza 100 mg di tessuto adiposo sottocutaneo addominale umano su una piattaforma basata su nanopozzetti16. L'attuale protocollo è ottimiz....
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Risultati
Questo flusso di lavoro è stato progettato per guidare l'elaborazione di campioni IMAT umani congelati per ottenere profili di espressione genica con risoluzione di singoli nuclei, consentendo l'identificazione del tipo di cellula. Qui viene presentato un campione IMAT rappresentativo di un partecipante allo studio SOMMA.
Il primo passo di qualsiasi analisi dei dati snRNA-seq è valutare la qualità dei dati per identificare i nuclei di scarsa qualità, che dovrebbero potenzialmente essere rimoss.......
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Discussione
La collaborazione con IMAT presenta diverse sfide intrinseche. Oltre alla sua limitata accessibilità, la resa del materiale campione è spesso molto scarsa e la "contaminazione" del muscolo scheletrico è quasi impossibile da evitare. Per ottenere il campione della migliore qualità, è necessario penetrare la fascia muscolare quando si inserisce l'ago da biopsia (per assicurarsi di non raccogliere tessuto adiposo sottocutaneo) e rimuovere quanto più tessuto muscolare possibile sezionando il campione al microscopio subito do.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Bryan Bergman, PhD presso l'Università del Colorado, per aver fornito l'immagine della biopsia IMAT nella Figura 1C dello studio MoTrIMAT (R01AG077956). Siamo grati per lo Studio dei Muscoli, della Mobilità e dell'Invecchiamento che fornisce il campione IMAT da cui i dati sono mostrati nella sezione dei risultati rappresentativi. Il National Institute on Aging (NIA) ha finanziato lo studio sui muscoli, la mobilità e l'invecchiamento (SOMMA; R01AG059416) e i relativi studi complementari SOMMA AT (R01AG066474) e SOMMA Knee OA (R01AG070647). Il supporto all'infrastruttura di studio è stato finanziato in parte dal NIA Claude D. Pepper Older American....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 µ m Filtri per siringhe Corning | Millipore Sigma | CLS431229 | |
| 1,7 mL Provette DNA LoBind | Eppendorf | 22431021 | provette a basso legame |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100x inibitore della proteasi | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
| 10X Separatore magnetico | 10X Genomics | 230003 | |
| 10X Vortex Adapter | 10X Genomics | ||
| 15 mL provette canoniche | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| provette coniche da 50 mL | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
| CellRanger | Genomics | N/A | |
| Kit di accessori Chromium iX | 10X Genomics | PN1000323 | |
| Chromium iX Controller | 10X Genomics | PN1000326 | |
| Chromium Next GEM Chip G Kit a cellula singola | 10X Genomics | PN1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit di perline in gel v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
| Chromium Next GEM Kit GEM a cellula singola v3.1 | 10X Genomics | PN1000130 | |
| Countess 3 Contatore di cellule automatizzato | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Contatore di cellule automatizzato |
| Countess Countess Contatori per camera di conteggio delle cellule | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DoubletFinder | R | N/A | |
| DPBS (senza calcio, senza magnesio) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Kit a doppio indice TT Set A, 96 rxns | 10X Genomica | PN1000215 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomics | PN2000048 | |
| Falcon 100 µ m Filtro cellulare | Corning Life Science | 352360 | |
| Falcon 40 µ m Filtro cellulare | Corning Life Science | 352340 | |
| Glicerina (glicerolo), 50% (v/v) Soluzione acquosa | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| KCL | Thermo Fisher Scientific AM9640G | ||
| Kit di costruzione della libreria v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
| MACS SmartStrainers (30µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler | Eppendorf | 6331000017 | |
| MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Mortaio e pestello | Logistica sanitaria | 14075 | |
| NucBlue Live Ready Probes Reagente | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Probumin Siero bovino Albumina senza acidi grassi, polvere | Sigma-Aldrich | 820024 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Inibitore dell'RNAsi Ribolock | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| Seurat | R | N/A | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SUPERasin 20 U/µ L | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | ||
| Omogeneizzatore tissutale | Glass-Col | 099C K54 | |
| Tris tampone pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific AM9855G | ||
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
| UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
Riferimenti
- Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
- Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipos....
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Ristampe e permessi
