Articolo metodologico

Costruzione di un modello ortotopico di xenotrapianto di carcinoma polmonare non a piccole cellule che imita la progressione della malattia e predice le attività farmacologiche

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DOI:

10.3791/66787

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10 maggio 2024

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1Thomas J. Long School of Pharmacy, University of the Pacific

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta un modello ortotopico di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) basato sull'inoculazione intrapolmonare di sferoidi multicellulari di cellule fluorescenti A549-iRFP. Il modello ricapitola gli stadi clinici del NSCLC e risponde al cisplatino, secondo il monitoraggio dinamico in vivo della fluorescenza a lunghezza d'onda lunga.

Abstract

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è una malattia altamente letale con un microambiente tumorale complesso ed eterogeneo. Attualmente, i modelli animali comuni basati sull'inoculazione sottocutanea di sospensioni di cellule tumorali non ricapitolano il microambiente tumorale nel NSCLC. Qui descriviamo un modello murino ortotopico di xenotrapianto di carcinoma polmonare che impiega l'inoculazione intrapolmonare di sferoidi multicellulari tridimensionali (MCS). In particolare, le cellule NSCLC umane fluorescenti (A549-iRFP) sono state coltivate in micropiastre a 96 pozzetti a basso attaccamento con collagene per 3 settimane per formare MCS, che sono state poi inoculate intercostalmente nel polmone sinistro di topi nudi atimici per stabilire il modello di cancro del polmone ortotopico.

Rispetto alla linea cellulare A549 originale, la MCS della linea cellulare A549-iRFP ha risposto in modo simile ai farmaci antitumorali. Il segnale fluorescente a lunga lunghezza d'onda delle cellule A549-iRFP era fortemente correlato con i marcatori comuni della crescita delle cellule tumorali, tra cui il volume degli sferoidi, la vitalità cellulare e il livello di proteine cellulari, consentendo così il monitoraggio dinamico della crescita del cancro in vivo mediante imaging fluorescente. Dopo l'inoculazione nei topi, lo xenotrapianto A549-iRFP MCS è progredito in modo affidabile attraverso fasi molto simili agli stadi clinici del NSCLC, tra cui l'espansione del tumore primario, l'emergere di tumori secondari vicini e le metastasi delle cellule tumorali al polmone destro controlaterale e agli organi remoti. Inoltre, il modello ha risposto al farmaco di riferimento contro il cancro del polmone, il cisplatino, con la tossicità prevista e una progressione del cancro più lenta. Pertanto, questo modello murino ortotopico di xenotrapianto di NSCLC servirebbe come piattaforma per ricapitolare la progressione della malattia e facilitare lo sviluppo di potenziali farmaci antitumorali.

Introduzione

Tra tutti i disturbi oncologici, il cancro ai polmoni non solo infligge la più alta perdita di vita, ma reclama anche il secondo numero più alto di nuovi pazienti ogni annonegli Stati Uniti. Questa devastante malignità rappresenta un grave ostacolo nell'assistenza sanitaria moderna, che richiede una comprensione più profonda della sua intricata biologia e modalità terapeutiche più efficaci2. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta l'85% del carcinoma polmonare e tende a svilupparsi in tumori solidi3. Una delle principali sfide nel cancro del polmone è il microambiente tumorale dinamico ed eterogeneo, che influenza profondamente la progressione del cancro e le risposte agli interventi terapeutici 4,5,6. Una comprensione più approfondita dell'interazione tra le cellule tumorali e il loro microambiente nelle diverse fasi del NSCLC richiede modelli patologici raffinati che ricapitolino le caratteristiche istologiche della progressione del NSCLC.

A questo proposito, i modelli animali ortotopici emergono come una strada promettente per la ricerca sul NSCLC. A differenza dei modelli di xenotrapianto sottocutaneo comunemente impiegati7, i modelli ortotopici presentano cellule tumorali che vengono inoculate direttamente nell'organo di origine. Per il cancro del polmone, ciò significa impiantare cellule tumorali direttamente nel tessuto polmonare 8,9. Di conseguenza, i modelli ortotopici di cancro del polmone imitano meglio il microambiente tumorale nativo, compresi i tessuti, i vasi e le componenti immunitarie vicine, migliorando così la loro rilevanza fisiologica e clinica.

Gli sferoidi multicellulari tridimensionali (MCS) rappresentano un altro approccio promettente per ricapitolare le caratteristiche dell'ambiente tumorale. La maggior parte dei tumori è caratterizzata dal complesso microambiente tumorale, comprese le varie interazioni cellula-cellula, la matrice extracellulare e i gradienti di ossigeno e sostanze nutritive 10,11. Le colture cellulari 2D tradizionali non hanno la complessità spaziale e strutturale per ricapitolare queste caratteristiche specifiche del tumore12. Al contrario, le MCS di dimensioni adeguate presentano una struttura eterogenea con un nucleo ipossico e necrotico, che ricapitola non solo il microambiente intratumorale ma anche la barriera fisiologica contro la penetrazione dei farmaci, che è uno dei principali meccanismi di resistenza ai farmaci nella terapia antitumorale 13,14,15.

Sfruttando sia i modelli animali ortotopici che le tecniche di coltura MCS, le MCS sono state inoculate a topi immunocompromessi per costruire con successo modelli ortotopici di cancro al seno e cancro alla prostata16,17. In questo articolo, riportiamo la metodologia dettagliata per costruire e caratterizzare un modello murino di xenotrapianto ortotopico di carcinoma polmonare. Questo metodo impiega l'inoculazione intrapolmonare di MCS 3D derivato da cellule di carcinoma polmonare umano fluorescente (A549-iRFP)18. Questo modello offre un'eccezionale opportunità per osservare la progressione in vivo del cancro del polmone attraverso stadi strettamente paralleli ai quattro stadi clinici del NSCLC. Inoltre, il cancro xenotrapianto di questo modello rispondeva al farmaco antitumorale del polmone clinicamente stabilito, il cisplatino.

Protocollo

Lo studio sugli animali è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Pacifico (Protocolli animali 19R10 e 22R10). Per il presente studio sono stati utilizzati otto topi nudi amimici maschi di età compresa tra 5 e 6 settimane, del peso di 20-25 g, allevati con la dieta per roditori di riferimento e alloggiati in condizioni prive di agenti patogeni (SPF). Le gabbie, le lettiere e l'acqua potabile venivano sterilizzate in autoclave e cambiate regolarmente. Uno schema dell'inoculazione del tumore nei topi è mostrato nella Figura 1. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Costituzione di MCS tridimensionali di celle A549-iRFP

  1. Incubare le cellule A549-iRFP (adenocarcinoma polmonare umano) in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C e farle crescere in un terreno di crescita completo DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina e 1 μg/mL di puromicina.
  2. Seminare le cellule A549-iRFP in una micropiastra sferoidale a fondo tondo a 96 pozzetti a bassissimo attacco con una densità di semina di 4.000 cellule/pozzetto, utilizzando 100 μL di terreno di crescita completo integrato con lo 0,3% di collagene.
  3. Centrifugare le micropiastre a 300 × g per 7 minuti a 4 °C per facilitare la formazione di MCS. Esaminare la morfologia MCS al microscopio per garantire l'aggregazione cellulare dopo la centrifugazione.
  4. Dopo 48 ore, aggiungere 100 μl di terreno di coltura completo a ciascun pozzetto per ottenere un volume totale di 200 μl di terreno di crescita per pozzetto.
  5. Sostituire 100 μL di terreno di coltura in ciascun pozzetto con un terreno di coltura completo fresco a giorni alterni.

2. Caratterizzazione di A549-iRFP MCS

  1. Osservare e visualizzare la morfologia di MCS utilizzando un microscopio e stimare il volume di MCS mediante simulazione con il software di riferimento di MATLAB basato sulle immagini del microscopio a contrasto di fase.
    1. Aprire un'immagine MCS nel software ImageJ.
    2. Utilizza le selezioni a mano libera per selezionare il bordo dell'MCS e aggiungerlo a ROI Manager.
    3. Fai clic su Modifica | Selezione | Crea maschera.
    4. Fai clic su Modifica | Inverti.
    5. Fare clic su File | Salva con nome | Tiff.
    6. Aprire il software ReViSP.
    7. Aprire l'immagine TIFF salvata facendo clic su Sfoglia.
    8. Fare clic su Avvia per completare la simulazione MCS.
  2. Misurare il segnale fluorescente iRFP utilizzando il sistema di imaging a infrarossi sul canale a 700 nm e quantificare il segnale fluorescente utilizzando il software (ad esempio, Image Studio).
    1. Aprire il software Image Studio.
    2. Nella scheda Canali , selezionare 700 e Intensità = 5.
    3. Nella scheda Controlli di scansione , selezionare 84 μm, Medio, 0,0 mm e Capovolgi immagine. Mantieni tutto il resto come predefinito.
    4. Fare clic su Avvia per avviare la scansione.
  3. Valutare e quantificare la vitalità cellulare utilizzando il saggio di vitalità cellulare 3D secondo il protocollo del fornitore.
  4. Valutare e quantificare le proteine cellulari utilizzando il saggio BCA secondo il protocollo del fornitore.

3. Selezione MCS per l'inoculazione del tumore

NOTA: Dopo che gli MCS sono stati seminati in micropiastre sferoidi e cresciuti per 2-3 settimane con un regolare scambio del terreno di crescita, selezionare MCS con le seguenti caratteristiche appropriate per l'inoculazione del tumore.

  1. Osservare la morfologia della MCS al microscopio e scegliere la MCS con una forma rotonda con bordi complessivamente lisci ma con 5-10 gemme ruvide (frecce nella Figura 2F) e un diametro compreso tra 700 e 800 μm.
  2. Misurare la fluorescenza iRFP (fare riferimento al passaggio 2.2) e selezionare l'MCS i cui segnali fluorescenti si trovano entro una deviazione standard della media.

4. Inoculazione intrapolmonare di MCS

NOTA: Utilizzare uno spray con alcol isopropilico al 70% per pulire la stazione chirurgica e gli strumenti prima di maneggiare gli animali.

  1. Anestetizzare ogni topo con un'iniezione IP di 80 mg/kg di ketamina e 12 mg/kg di xilazina; Pizzicare i piedini del mouse con una pinza per garantire un'anestesia completa.
  2. Iniettare 10 μL di buprenorfina cloridrato (0,3 mg/mL) per via sottocutanea per ridurre il dolore.
  3. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza.
  4. Posiziona il mouse in una posizione dorsale e fissa gli arti in una posizione di allungamento con dei nastri.
  5. Sterilizzare la pelle della schiena con bastoncini di iodio e tampone imbevuto di alcol.
  6. Praticare un'incisione di 0,5-1 cm utilizzando le forbici chirurgiche sul lato posteriore sinistro (Figura 1B). Usa con attenzione una pinza per separare i tessuti muscolari e adiposi fino a quando la parete toracica e il movimento polmonare sono visibili.
  7. Trasferire un MCS selezionato da una micropiastra in una capsula di Petri di vetro contenente PBS ghiacciato, utilizzando una pipetta.
  8. Collegare un ago da 20 G a una siringa di vetro da 100 μL, preraffreddarla con ghiaccio e aspirare 20 μL di una miscela preraffreddata di PBS e Matrigel (1:1 v/v).
  9. Utilizzare la siringa per aspirare rapidamente un MCS dalla capsula di Petri in un volume minimo di miscela PBS-Matrigel, mantenendo l'MCS nella parte metallica dell'ago.
    NOTA: Mantenere una presa salda sulla siringa e sullo stantuffo per evitare che l'MCS scivoli fuori dall'ago.
  10. Inserire delicatamente l'ago verticalmente tra due costole a una profondità di ~3 mm e iniettare lentamente tutta la miscela da 20 μl di PBS e Matrigel che contiene l'MCS.
    NOTA: Evitare una forza eccessiva durante l'inserimento per evitare danni al polmone, al sistema vascolare o al cuore.
  11. Rimuovere con cautela l'ago e applicare un triplo unguento antibiotico sulla ferita.
  12. Sigillare l'incisione con clip chirurgiche, che devono essere rimosse dopo 2 settimane.
    NOTA: Non suturare l'incisione perché le linee di sutura potrebbero interferire con l'imaging a fluorescenza. I topi nudi sono in grado di guarire naturalmente dopo l'intervento chirurgico.
  13. Posiziona l'animale su un termoforo a infrarossi e coprilo con salviette da laboratorio per mantenere la temperatura corporea. Monitora l'animale per almeno 30-60 minuti fino a quando non si sveglia e si muove correttamente.
  14. Iniettare 10 μL di buprenorfina cloridrato (0,3 mg/mL) per via sottocutanea 3 volte al giorno per le prime 48 ore per ridurre il dolore.

5. Monitoraggio post-chirurgico

  1. Misurare il peso corporeo ogni 3-4 giorni.
  2. Misurare il segnale fluorescente iRFP dallo xenotrapianto tumorale ogni 3-4 giorni su un sistema di imaging di piccoli animali a canale 700 nm in quattro posture: sinistra, destra, dorsale e ventrale, mentre i topi sono tenuti in anestesia mediante inalazione di isoflurano (portata: 1,5-2 L/min di ossigeno contenente isoflurano all'1,5%) per 2-3 minuti.
  3. Quantificare l'intensità fluorescente netta del cancro xenotrapianto in vivo utilizzando un software (ad esempio, Image Studio).
    1. Utilizzare un rettangolo fisso (A1, 200 x 125 pixel) come finestra di campionamento per l'area del torace dei topi.
    2. Utilizzare la funzione a mano libera per tracciare la forma dei mouse all'interno del rettangolo (A1) e misurare l'intensità della fluorescenza (F1) nell'area A1.
    3. Usa un altro rettangolo più piccolo (A2, 25 x 40 pixel) per misurare la fluorescenza di fondo (F2) dei topi nella zona della coscia.
    4. Utilizzare l'equazione (1) per calcolare l'intensità fluorescente netta del cancro xenotrapianto in ciascun topo:
      figure-protocol-1(1)

Risultati

Caratterizzazione di A549-iRFP MCS
Gli MCS A549-iRFP sono stati coltivati con successo in micropiastre sferoidi con l'assistenza del collagene e della centrifugazione. Quando la MCS ha raggiunto un diametro di circa 500 μm dopo 1 settimana, sia la MCS A549 che la MCS A549-iRFP sono state esposte a una varietà di farmaci e formulazioni antitumorali per 3 giorni e poi mantenute in terreno di crescita libero da farmaci per altri 4 giorni. L'MCS A549-iRFP ha mostrato un modello di risposta che rispecchia da vicino quello delle cellule A549 madri. A549 e A549-iRFP MCS hanno mostrato curve dose-risposta e valori IC50 simili a quelli del cisplatino, uno dei farmaci antitumorali di prima linea contro il cancro del polmone (Figura 2A). La vitalità di A549 e A549-iRFP MCS è stata inibita in misura simile da altri farmaci o formulazioni antitumorali (Figura 2B).

Gli MCS A549-iRFP sono stati monitorati per un periodo fino a 6 settimane mediante fluorescenza iRFP, vitalità cellulare e livelli di proteine cellulari. Il volume di MCS è stato stimato mediante simulazione software basata sulle immagini del microscopio a contrasto di fase e la morfologia simulata ha mostrato forme simili a quelle riprese al microscopio e al segnale fluorescente (Figura 2C). La vitalità cellulare di A549-iRFP MCS è stata quantificata mediante saggio di vitalità cellulare 3D e il test è stato convalidato con MCS di varie dimensioni da 350 a 950 μm di diametro. Non sono state osservate differenze significative tra i vari rapporti di volume tra il terreno di crescita contenente MCS e il reagente del saggio e tra i diversi tempi di agitazione di 5 minuti e 10 minuti. (Figura supplementare S1). Tutti e quattro i biomarcatori sono aumentati con il tempo, con variazioni maggiori nei punti temporali successivi (Figura 2D). La fluorescenza iRFP ha mostrato forti correlazioni con le altre tre misure quantitative più tradizionali di MCS: volume (Pearson r = 0,9307, p < 0,0001), vitalità cellulare (Pearson r = 0,7666, p < 0,0001) e proteina cellulare (Pearson r = 0,7317, p < 0,0001) (Figura 2E).

Progressione tumorale nei topi
Dopo la crescita per 2-3 settimane, A549-iRFP MCS con caratteristiche appropriate, tra cui morfologia, diametro MCS, bordi adeguatamente ruvidi e segnale fluorescente (per i parametri dettagliati, vedere la sezione 3 del protocollo), sono stati selezionati per l'inoculazione del tumore. Dopo l'intervento chirurgico di inoculazione del tumore, il peso corporeo dei topi portatori di tumore è stato misurato ogni 3 giorni e presentato come rapporto di variazione rispetto al peso del giorno 0 subito prima dell'intervento chirurgico. Il peso corporeo del topo è diminuito leggermente dopo l'intervento chirurgico e si è ripreso rapidamente entro 1 settimana. Senza trattamento, il peso corporeo è aumentato gradualmente fino al ~ Giorno 40 ma è diminuito drasticamente (~ 15%) nella settimana successiva, portando all'eutanasia (sovradosaggio di anestetico triplo: 80 mg/kg di ketamina e 12 mg/kg di xilazina tramite iniezione IP) dei topi secondo le linee guida IACUC (Figura 3A). I topi portatori di tumore sono stati sottoposti a imaging ogni 3 giorni in quattro posture: lato sinistro, dorsale, destro e ventrale. Tra queste, la sinistra (dove viene inoculato il tumore) e la ventrale (dove si possono osservare entrambi i lati dei polmoni) sono state selezionate come posture chiave per la quantificazione dell'intensità netta fluorescente secondo l'equazione (1) (Figura 3B, C). L'intensità netta della fluorescenza da entrambe le posture ha mostrato una tendenza simile alla progressione del tumore, con la fluorescenza dal lato ventrale che cresceva leggermente più lentamente del lato sinistro.

Lo xenotrapianto di MCS in questo modello ortotopico è progredito attraverso fasi distinte che rispecchiano i quattro stadi clinici del NSCLC (Figura 3D)18,19,20. Intorno all'ottavo giorno dopo l'inoculazione di MCS, è emersa una fluorescenza concentrata nel polmone sinistro, indicando l'instaurazione di un tumore localizzato in linea con il NSCLC di stadio 1 in contesti clinici. Entro circa l'11° giorno, la fluorescenza si è notevolmente intensificata e/o dispersa in più siti nel polmone sinistro, indicando la presenza di tumori simili al NSCLC di stadio 2. Successivamente, approssimativamente al giorno 18, sono stati osservati segnali fluorescenti aumentati dal lato ventrale, suggerendo una progressione di stadio 3 dello xenotrapianto. Inoltre, l'esame anatomico e l'imaging ex vivo hanno rivelato la crescita tumorale sulla superficie del cuore, un segno distintivo significativo del NSCLC allo stadio 3. Entro circa il 27° giorno dopo l'inoculazione di MCS, la fluorescenza perfusa è apparsa su entrambi i lati del polmone e l'anatomia del torace aperto ha rivelato una crescita tumorale perfusa nel cuore, nella trachea e nei principali vasi sanguigni, indicativa di metastasi tumorali simili al NSCLC allo stadio 4.

Risposta dei topi portatori di tumore al cisplatino
È stato condotto uno studio pilota di efficacia su questo modello murino di carcinoma polmonare ortotopico. Dieci giorni dopo l'inoculazione del tumore, 5 mg/kg di cisplatino o soluzione fisiologica sono stati iniettati attraverso la vena caudale di topi portatori di tumore, un'iniezione a settimana, per un totale di due iniezioni. Le immagini del lato ventrale su topi portatori di tumore sono presentate nella Figura 4A. Il peso corporeo e la fluorescenza tumorale sono stati monitorati ogni 3-4 giorni. Rispetto al gruppo salino normale, i topi del gruppo cisplatino hanno perso peso corporeo significativo dopo ogni iniezione di cisplatino, ma si sono ripresi nelle settimane successive al trattamento con cisplatino (Figura 4B). L'intensità netta della fluorescenza nel gruppo cisplatino ha mostrato una tendenza di aumento più lenta rispetto a quella del gruppo salino (Figura 4C). Al termine del monitoraggio della fluorescenza in vivo, gli animali sono stati sacrificati e i loro polmoni sezionati e sottoposti a imaging mediante fluorescenza. Dopo la normalizzazione da parte della proteina totale del tessuto, è stato confermato che l'intensità fluorescente dei polmoni sezionati dai topi nel gruppo cisplatino è inferiore a quella del gruppo salino normale. (Figura 4E). Nell'imaging fluorescente ventrale (Figura 4A), le immagini nei rettangoli rossi indicano la prima volta in cui la fluorescenza tumorale è stata visualizzata sia nel polmone sinistro che in quello destro, che è un indicatore chiave di metastasi tumorali al NSCLC in stadio IV. Il cisplatino, uno dei farmaci di prima linea per il cancro del polmone, ha rallentato le metastasi tumorali dal polmone sinistro al polmone destro (Figura 4D).

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Figura 1: Diagramma di flusso dello studio. (A) Semina di cellule A549-iRFP in micropiastre sferoidi per formare MCS con l'assistenza di collagene e centrifugazione. (B) Inoculazione intrapolmonare di A549-iRFP MCS con caratteristiche appropriate nel polmone sinistro di un topo per costruire il modello di xenotrapianto di cancro polmonare ortotopico, imitando i quattro stadi del cancro del polmone in contesti clinici. La siringa bianca contenente un MCS indica l'inoculazione del tumore, mentre le due siringhe rosse indicano il trattamento farmacologico somministrato attraverso la vena caudale. Abbreviazione: MCS = sferoide multicellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Caratterizzazione di A549-iRFP MCS. (A) Curve dose-risposta di A549-iRPF MCS e A549 MCS a cisplatino dopo 3 giorni di esposizione e 4 giorni di crescita libera da farmaci (media ± SD, N = 3-4). (B) Vitalità cellulare di A549-iRFP MCS dopo 3 giorni di esposizione a trattamenti antitumorali (cisplatino, paclitaxel o due formulazioni di farmaci sviluppate internamente) e crescita libera da farmaci per 4 giorni (media ± SD, N = 3-4). (C) Studi morfologici di MCS rappresentativa di A549-iRFP dopo 1-6 settimane di coltura mediante microscopia in fase di contrasto (C1, barra della scala = 500 μm), microscopia confocale fluorescente (C2) e simulazione software (C3). (D) Variazione dinamica della fluorescenza iRFP, del volume, della vitalità cellulare e della proteina cellulare di A549-iRFP MCS nell'arco di 1-6 settimane (N = 10 per fluorescenza e volume iRFP; N = 5 per la vitalità cellulare e la proteina cellulare). (E) Correlazione della fluorescenza iRFP di A549-iRFP MCS con le altre tre misure tradizionali di crescita (volume, vitalità cellulare e proteina cellulare) in 1-6 settimane (N = 60). (F) Un esempio di MCS A549-iRFP con caratteristiche appropriate per l'inoculazione del tumore (barra della scala = 500 μm). Abbreviazione: MCS = sferoide multicellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Progressione tumorale nel modello murino ortotopico di NSCLC. (A) Variazione del peso corporeo dei topi dopo l'inoculazione del tumore (media ± SEM, N = 5). (B) Variazione dinamica dell'intensità fluorescente netta nei topi portatori di tumore basata sull'imaging del lato sinistro (N = 5). (C) Variazione dinamica dell'intensità fluorescente netta nei topi portatori di tumore basata sull'imaging del lato ventrale (N = 5). (D) Progressione del cancro che imita i quattro stadi clinici del NSCLC. Imaging del lato sinistro, imaging del lato ventrale, osservazione anatomica (le frecce gialle indicano tumori nel polmone e sulla superficie del cuore) e imaging ex-vivo di topi portatori di tumore rappresentativi in quattro fasi. Questa figura è tratta da Huang et al.18. Abbreviazione: NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Risposta dei topi portatori di tumore al cisplatino. (A) Imaging del lato ventrale di topi portatori di tumore dopo il trattamento con soluzione fisiologica o cisplatino (le immagini in rettangoli rossi indicano quando la fluorescenza tumorale può essere visualizzata per la prima volta sia nei polmoni sinistro che in quello destro). (B) Variazione del peso corporeo dei topi portatori di tumore dopo trattamenti con soluzione salina o cisplatino (media ± SEM, N = 3-4). (C) Variazione dinamica dell'intensità fluorescente netta nei topi portatori di tumore dopo trattamenti con soluzione salina o cisplatino sulla base dell'imaging del lato ventrale (media ± SEM, N = 3-4). (D) Percentuale di topi che mostrano fluorescenza tumorale sia sul polmone sinistro che su quello destro. (E) Intensità fluorescente normalizzata dei polmoni sezionati da topi sacrificati al termine dell'imaging fluorescente in vivo (media ± SEM, N = 3-4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1 supplementare: Saggio 3D di vitalità cellulare su A549-iRFP MCS di vari diametri. (A) ~350 μm; (B) ~550 μm; (C) ~750 μm; (D) ~950 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La costruzione di A549-iRFP MCS è una procedura di laboratorio semplice e altamente riproducibile e può essere tradotta in formazione di MCS per più linee cellulari. La MCS generata con l'aiuto della centrifugazione e del collagene mostra una struttura più integra e solida-simile a quella del tumore entro 3-4 giorni. Questo metodo garantisce la formazione di robusti sferoidi che mantengono la loro struttura integrale per periodi prolungati, in genere 2-3 settimane o anche più a lungo fino a quando iniziano a emergere piccole gemme. Utilizzando la centrifugazione e il collagene, abbiamo standardizzato la formazione di MCS, garantendone la coerenza e l'affidabilità nel nostro modello sperimentale. Questo approccio migliora la riproducibilità dei nostri risultati e riduce al minimo la variabilità nella cinetica di crescita del tumore, fornendo così una piattaforma più solida per lo studio della biologia dei tumori e degli interventi terapeutici.

A differenza delle tradizionali colture cellulari monostrato 2D, la MCS 3D può crescere in un arco di tempo molto più lungo, almeno 6 settimane in questo studio. Per monitorare la crescita e la progressione del cancro, una misurazione quantitativa dinamica e a lungo termine è molto utile. Molti saggi MCS 3D esistenti sono distruttivi durante le misurazioni, limitando così la loro utilità per le valutazioni a lungo termine. La natura non distruttiva della misurazione dei segnali fluorescenti iRFP consente il monitoraggio continuo e a lungo termine della crescita delle cellule tumorali in 3D MCS. Questa funzione è particolarmente utile per valutare gli effetti dell'esposizione cronica ad agenti antitumorali e per catturare l'evoluzione dinamica delle cellule tumorali nel tempo. I segnali fluorescenti iRFP emessi dall'MCS 3D A549-iRFP hanno mostrato una forte correlazione con le tradizionali misurazioni quantitative della crescita degli sferoidi, tra cui il volume degli sferoidi, la vitalità cellulare e i livelli di proteine cellulari. Ciò evidenzia l'affidabilità dei segnali fluorescenti come proxy per la valutazione della crescita delle cellule tumorali nella MCS. La lunga lunghezza d'onda dei segnali fluorescenti iRFP consente la quantificazione della crescita e della progressione del cancro nei piccoli animali, che è fondamentale per lo sviluppo preclinico di farmaci antitumorali.

Per garantire la coerenza di questo modello ortotopico di NSCLC, la MCS deve essere accuratamente selezionata per l'inoculazione intrapolmonare. Dimensioni e intensità fluorescenti simili dell'MCS sono necessarie per ridurre al minimo la variazione; l'inoculazione di MCS più grandi tende a causare una maggiore variazione nella progressione del tumore. Inoltre, il controllo della rugosità della superficie MCS svolge un ruolo fondamentale nella riduzione della variazione. Mentre alcuni MCS hanno mantenuto i loro bordi lisci man mano che diventavano più grandi, altri mostravano bordi più ruvidi man mano che crescevano. Nelle nostre mani, l'MCS integrale, simile a un tumore solido, dopo 2-3 settimane di crescita in coltura cellulare con 5-10 gemme ai bordi, ha prodotto una crescita tumorale più uniforme nei topi, mentre quelli senza bordi ruvidi o quelli con strutture allentate e troppe gemme hanno prodotto modelli più diversi di crescita tumorale dopo l'inoculazione.

Durante il processo di trasferimento MCS, è essenziale maneggiare l'ago da 20 G con grande cura. L'MCS deve essere mantenuto all'interno dello smusso o della parte metallica dell'ago per limitare potenziali danni. La scelta della dimensione dell'ago è stata fatta deliberatamente per bilanciare tra la garanzia della vitalità della MCS durante l'inoculazione e la minimizzazione del potenziale danno ai polmoni del topo. Aghi di dimensioni maggiori potrebbero potenzialmente causare danni ai tessuti del topo. Se la MCS si blocca all'interno dell'ago o se si osservano più punti fluorescenti nei primi giorni dopo l'inoculazione, può indicare che la MCS inoculata è stata danneggiata durante l'inoculazione. I topi che mostravano queste caratteristiche sono stati esclusi da ulteriori studi e classificati come inoculazione non riuscita.

Gli sferoidi multicellulari (MCS) sono stati inoculati nel polmone sinistro piuttosto che nel polmone destro in base a considerazioni anatomiche. Il polmone sinistro ha due lobi impilati uno sopra l'altro, fornendo un'area target più coerente e accessibile rispetto al polmone destro, che ha tre lobi situati uno accanto all'altro. Pertanto, il polmone sinistro consente un'inoculazione altamente affidabile in un'area specifica, vale a dire il lobo superiore sinistro, che aiuta a ridurre le variazioni nell'origine e nella progressione del tumore.

Oltre alla fluorescenza iRFP del torace, il peso corporeo dei topi portatori di tumore funge da importante indicatore corroborativo del carico tumorale. Mentre il cancro xenotrapianto progrediva dopo l'inoculazione di MCS, i topi hanno mostrato un comportamento normale, tra cui mangiare, bere e attività quando erano svegli, fino a circa il giorno 40, quando il pesante carico tumorale, come dimostrato dalla forte fluorescenza iRFP del torace, ha provocato un notevole calo del peso corporeo e la perdita del comportamento normale. Seguendo le linee guida umanitarie, gli animali sono stati soppressi con una perdita del 15-20% di peso corporeo. Sebbene i tempi della perdita di peso variassero tra i lotti, corrispondono alla perdita del normale comportamento degli animali e quindi possono anche essere utilizzati come indicatore affidabile della salute degli animali.

La progressione del cancro nel modello ortotopico di NSCLC è stata monitorata principalmente attraverso l'imaging fluorescente del lato sinistro e ventrale, che ha mostrato una crescita tumorale costante e costante dopo l'inoculazione di MCS. La fluorescenza dal lato ventrale ha mostrato un aumento più lento rispetto al lato sinistro, probabilmente a causa di (1) la profondità di iniezione e (2) la presenza di tumori ortotopici e sottocutanei in stadi avanzati di cancro. In particolare, la MCS è stata inoculata attraverso le ossa costali nel torace, che l'ha depositata sulla superficie dorsale del polmone sinistro, richiedendo così un tempo di ritardo per la crescita della MCS fino alla superficie ventrale del polmone sinistro per essere visualizzata. Man mano che il tumore cresceva, occasionalmente si estendeva sulla superficie interna della parete toracica, avvicinandola così allo scanner fluorescente per fornire segnali più elevati per l'imaging del lato sinistro. Pertanto, l'imaging fluorescente sul lato ventrale presentava in modo più accurato il tumore nel polmone, ma di solito richiedeva più tempo per rilevare il tumore. Al termine dell'imaging fluorescente in vivo , gli animali sono stati sacrificati e sottoposti a dissezione a torace aperto e imaging ex vivo , che non solo ha confermato l'instaurazione del tumore ortotopico dall'inoculazione di MCS, ma ha anche mostrato molteplici caratteristiche anatomiche che ricapitolavano i quattro stadi clinici del NSCLC nell'uomo.

Nello studio pilota di efficacia, la forte correlazione tra l'imaging ex vivo dei polmoni e l'imaging in vivo di topi portatori di tumore corrobora l'affidabilità della metodologia di imaging dinamico a fluorescenza in vivo . Il modello ortotopico di NSCLC ha risposto in modo affidabile ai trattamenti antitumorali sia per la crescita più lenta del tumore come indicatore chiave dell'efficacia terapeutica sia per la perdita di peso corporeo come indicatore chiave della tossicità dei farmaci. Tali risposte hanno dimostrato che il modello è uno strumento prezioso per la valutazione preclinica e lo sviluppo di candidati farmaci antitumorali. La metastasi, un segno distintivo del cancro del polmone, è stata ricapitolata fedelmente nel modello e, cosa più importante, è stata ostacolata in modo affidabile dal farmaco antitumorale cisplatino. In questo studio pilota è stata osservata una crescita tumorale più lenta con solo due iniezioni di cisplatino, suggerendo che un effetto antitumorale più significativo del cisplatino deriverebbe da un regime clinicamente più rilevante di quattro dosi settimanali.

Il modello ortotopico di NSCLC di questo rapporto presenta diversi importanti vantaggi rispetto a una serie di modelli animali comuni di cancro al polmone. Rispetto ai modelli di xenotrapianto sottocutaneo di carcinoma polmonare, questo modello offre un microambiente tissutale più rilevante attorno ai tumori; Rispetto al modello murino geneticamente modificato, questo modello offre procedure sperimentali più convenienti e una progressione del tumore e una sopravvivenza animale più riproducibili. Un confronto completo tra questo modello e altri modelli di cancro del polmone è disponibile nella nostra precedente pubblicazione18. Simile ad altri modelli animali di xenotrapianto, una limitazione di questo modello è la mancanza di un sistema immunitario completo, che è una componente importante dei tumori umani. Inoltre, gli MCS inoculati in questo modello sviluppano occasionalmente il tumore primario xenotrapianto sulla superficie interna della parete toracica. Pertanto, le procedure sperimentali per rilevare facilmente e minimizzare tale sviluppo dovrebbero essere incluse negli studi futuri per migliorare questo modello. Inoltre, saranno condotti studi che coinvolgeranno entrambi i sessi per ottenere una comprensione più completa della biologia tumorale e delle risposte al trattamento nel NSCLC. In conclusione, il modello di xenotrapianto di carcinoma polmonare ortotopico murino di questo rapporto si pone come uno strumento pionieristico e robusto per ricapitolare la progressione del cancro del polmone e per valutare i trattamenti antitumorali. Questo modello ha un immenso potenziale per far progredire la nostra comprensione della patologia del NSCLC e per sviluppare i corrispondenti interventi terapeutici.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni SAAG e SEED dell'Università del Pacifico. Ringraziamo il Dr. William Chan per aver concesso l'accesso al sistema Odyssey Infrared Imaging 205 e il Dr. John Livesey per aver concesso l'accesso al lettore di piastre SpectraMax iD3. Ringraziamo la Dott.ssa Melanie Felmlee per la consulenza tecnica sui protocolli per gli animali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100 µ L Siringa in vetroHamiltonPart/REF #80601
Ago da 20 gThermo Fisher Scientific Inc.826D
 Corning15-100-173
A549-iRFPImanis Scienze della vita CL082-STAN
AIN-93M Dieta per roditori maturi Diete di ricerca, Inc.
Topo nudo atimicoCharles River Laboratories, Inc.Codice ceppo: 490; omozigote
BCAPierce23227
Buprenorfina cloridratoPatterson NumeroNDC veterinario: 42023-179-05
CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare 3DPromegaG9683
CollageneGibcoA1064401 
DMEMCorningMT10013CV
Siero fetale bovino (FBS)Cytiva HyCloneSH3039603
ImageJStrumento open source (https://imagej.net/ij/)N/A
Image Studio LI-CORversione 5.2
IsofluranoPatterson VeterinarioNDC Numero: 17033-0091-25
KetaminaPatterson VeterinarioNDC Numero: 50989-0161-06
Microscopio Keyence: BZ-X710
MatrigelCorningCB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System LI-CORNumero di modello: 9140
PBSCorningMT21040CV
Pearl Trilogy sistema di imaging per piccoli animali LI-CORNumero di modello: 9430
Penicillina-StreptomicinaCorningMT30002CI
PuromicinaThermo Fisher Scientific Inc.
software ReViSP di MATLAB Strumento open source su Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)N/A
Clip chirurgiche - Sistema AutoClipStrumenti per la scienza fine12020-00
XylazinePatterson VeterinaryNDC Numero: 61133-6017-01
14 Micropiastra sferoidale a bassissimo attacco a 966 pozzetti D10012MNumero di modello AAJ67236XF

Riferimenti

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials. J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).
  4. Ducote, T. J., et al. Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers. Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).
  5. Lim, Z. F., Ma, P. C. Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy. J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).
  6. Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).
  7. Peterson, J. K., Houghton, P. J. Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development. Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).
  8. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).
  9. Mclemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Zanoni, M., et al. 3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103(2016).
  11. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).
  12. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  13. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  14. Huang, B. W., Gao, J. Q. Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research. J Control Release. 270, 246-259 (2018).
  15. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  16. Sethi, P., et al. 3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation. Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).
  17. Valta, M. P., et al. Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer. Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).
  18. Huang, Y., et al. Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer. J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).
  19. Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. Lung cancer: Biology and treatment options. Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).
  20. Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. The eighth edition lung cancer stage classification. Chest. 151 (1), 193-203 (2017).

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