Questo protocollo descrive un metodo efficiente per rilevare quantitativamente il danno ossidativo del DNA nelle cellule MCF-7 mediante tecnologia ELISA.
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Articolo metodologico
Quantificazione del livello di 8-oxo-dG utilizzando il test ELISA per valutare il danno ossidativo al DNA nelle cellule MCF-7
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La base 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dG) è la forma predominante di danno ossidativo del DNA comunemente osservato. La compromissione del DNA ha un profondo impatto sull'espressione genica e funge da fattore fondamentale nella stimolazione dei disturbi neurodegenerativi, del cancro e dell'invecchiamento. Pertanto, la quantificazione precisa dell'8-oxoG ha un significato clinico nello studio delle metodologie di rilevamento del danno al DNA. Tuttavia, al momento, gli approcci esistenti per il rilevamento dell'8-oxoG pongono sfide in termini di praticità, convenienza, convenienza e maggiore sensibilità. Abbiamo impiegato la tecnica ELISA (Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), un metodo colorimetrico altamente efficiente e rapido, per rilevare variazioni nel contenuto di 8-oxo-dG in campioni di cellule MCF-7 stimolati con diverse concentrazioni di perossido di idrogeno (H2O2). Abbiamo determinato la concentrazione di H2O2 che induce il danno ossidativo nelle cellule MCF-7 rilevando il suo valore IC50 nelle cellule MCF-7. Successivamente, abbiamo trattato le cellule MCF-7 con 0, 0,25 e 0,75 mM H2O2 per 12 ore e abbiamo estratto 8-oxo-dG dalle cellule. Infine, i campioni sono stati sottoposti a ELISA. Seguendo una serie di passaggi, tra cui la diffusione della piastra, il lavaggio, l'incubazione, lo sviluppo del colore, la terminazione della reazione e la raccolta dei dati, abbiamo rilevato con successo i cambiamenti nel contenuto di 8-oxo-dG nelle cellule MCF-7 indotte da H2O2. Attraverso tali sforzi, miriamo a stabilire un metodo per valutare il grado di danno ossidativo del DNA all'interno dei campioni cellulari e, così facendo, a far progredire lo sviluppo di approcci più convenienti e convenienti per il rilevamento del danno al DNA. Questo sforzo è pronto a dare un contributo significativo all'esplorazione delle analisi associative tra il danno ossidativo del DNA e vari domini, tra cui la ricerca clinica sulle malattie e l'individuazione di sostanze tossiche.
Introduzione
Il danno ossidativo del DNA è una conseguenza di uno squilibrio tra la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il sistema di difesa antiossidante cellulare1. Coinvolge principalmente l'ossidazione delle basi di DNA, purina e pirimidina 2,3. Questa modificazione ossidativa delle basi del DNA non solo compromette l'integrità del genoma, ma comprende anche un'ampia gamma di problemi patologici, tra cui cancro, malattie neurodegenerative e malattie cardiovascolari 4,5. La base guanina nel DNA ha il più basso potenziale ....
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Protocollo
1. Costruzione di un modello didanno ossidativo del DNA indotto da H2O2 in cellule MCF-7
- Recupero cellulare MCF-7
- Trasferire rapidamente la provetta criogenica per colture cellulari, che contiene 3,5 x 106 cellule MCF-7 e viene conservata in frigorifero a -80°C, in una scatola di schiuma contenente azoto liquido. Recuperare la provetta con una pinza e metterla in un bagno d'acqua a temperatura costante di 37 °C per circa 1 minuto per scongelare le cellule conservate.
NOTA: Durante il processo di scongelamento a bagnomaria, agitare le cellule in modo intermittente per garantire un ri....
- Trasferire rapidamente la provetta criogenica per colture cellulari, che contiene 3,5 x 106 cellule MCF-7 e viene conservata in frigorifero a -80°C, in una scatola di schiuma contenente azoto liquido. Recuperare la provetta con una pinza e metterla in un bagno d'acqua a temperatura costante di 37 °C per circa 1 minuto per scongelare le cellule conservate.
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Risultati
Come illustrato nella Figura 3, l'asse X denota la concentrazione di H2O2 applicata alle cellule MCF-7, mentre l'asse Y indica la vitalità cellulare. Il trattamento con 0,75 mM per 12 ore ha ridotto la vitalità delle cellule MCF-7 al 67%. In concomitanza con l'aumento della concentrazione, c'è stata una significativa diminuzione della vitalità delle cellule MCF-7, in particolare a una concentrazione di 1,5 mM, dove la vitalità è diminuita al di sotto del 3% (Tab.......
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Discussione
Lo sviluppo di metodi ELISA riveste grande importanza sia per le metodologie di rilevamento del danno al DNA esistenti che per quelle nuove. Rispetto alle tradizionali tecniche di HPLC e spettrometria di massa, questo approccio non solo è facile da usare, ma mostra anche un'elevata sensibilità e soddisfa le esigenze dello screening ad alto rendimento30. Ciò consente il monitoraggio dell'8-oxo-dG in studi di screening della malattia su larga scala, facilitando una comprensione più profonda della co.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal team di ricerca innovativa dell'istituto di istruzione superiore di Jiangsu per la scienza e la tecnologia (2021), dal programma del Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023), dal programma tecnologico chiave dei progetti tecnologici per il sostentamento del popolo di Suzhou (SKY2021029), dal progetto aperto della biobanca delle risorse cliniche del Jiangsu (TC2021B009), dal progetto del laboratorio chiave statale di medicina e protezione dalle radiazioni, Università di Soochow (GZK12023013), programmi del Suzhou Vocational Health College (SZWZYTD202201) e Progetto Qing-Lan della....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Kit conteggio cellule-8 | Dojindo | CK04 | |
| Piastra contacellule | QiuJing | XB-K-25 | |
| CO2 incubatore | Thermo | 51032872 | |
| DMEM basic(1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prism X9 | GraphPad Software | analisi statistica | |
| centrifuga ad alta velocità | Thermo | 9AQ2861 | |
| Kit ELISA umano 8-oxo-dG | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ Pipette | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipette | Rainin | 17014392 | |
| serbatoio di azoto liquido | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 CELL | BNCC | BNCC100137 | |
| Multiskan FC fotometro per micropiastre | Thermo | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina, 100X | Beyotime | C0222 | |
| Microscopio trinoculare per cellule vive | Motic | 1.1001E+12 | |
| Congelatore a bassissima temperatura | Haire | V118574 |
Riferimenti
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
- Cadet, J....
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Ristampe e permessi
