Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Summary

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Abstract

Le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) sono fondamentali per il corretto funzionamento della retina. La disfunzione dell'RPE è coinvolta nella patogenesi di importanti malattie della retina, come la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la retinopatia diabetica. Presentiamo un approccio semplificato per l'isolamento dell'RPE dagli occhi adulti murina. A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio consente l'isolamento e la coltura di RPE altamente puro da topi adulti. Questo metodo semplice e veloce non richiede grandi competenze tecniche ed è realizzabile con strumenti scientifici e reagenti di base. Gli RPE primari sono isolati da topi di fondo C57BL/6 di età compresa tra 3 e 14 settimane mediante enucleazione dell'occhio seguita dalla rimozione del segmento anteriore. La tripsinizzazione enzimatica e la centrifugazione vengono utilizzate per dissociare e isolare l'RPE dall'oculare. In conclusione, questo approccio offre un protocollo rapido ed efficace per l'utilizzo dell'RPE nello studio della funzione e della malattia retinica.

Introduction

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato cellulare specializzato che riveste la membrana di Bruch, situata tra i fotorecettori e la coroide¹. Le cellule RPE svolgono un ruolo fondamentale nel corretto funzionamento della retina. Le cellule RPE trasportano il glucosio e la vitamina A ai fotorecettori, promuovono la visione mediante la reisomerizzazione di all-trans retinal in 11-cis retinal e mantengono i segmenti esterni del fotorecettore attraverso la fagocitosi dei segmenti esterni eliminati, rimuovono l'acqua dallo spazio sottoretinico, formano la barriera emato-retinica esterna attraverso la presenza di giunzioni strette e secernono fattori di crescita neurotropici (come il fattore derivato dall'epitelio pigmentato, e fattore di crescita dei fibroblasti di base) che supportano i fotorecettori². La disfunzione delle cellule RPE è coinvolta nella patogenesi di varie retinopatie, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la retinopatia diabetica ^3,4,5. Gli studi in vitro con cellule RPE sono fondamentali per migliorare la nostra comprensione della patogenesi di queste malattie. Le cellule RPE primarie sono di gran lunga preferite per questi studi poiché le linee cellulari RPE, sebbene prontamente disponibili, mancano delle caratteristiche chiave delle cellule RPE primarie.

Mentre varie specie sono state utilizzate come fonti di cellule primarie di RPE, i topi hanno il vantaggio di utilizzare le modificazioni genetiche per aiutare a comprendere la patogenesi delle retinopatie. I protocolli precedentemente descritti per isolare le cellule RPE dai roditori richiedono l'uso di animali neonatali, sono lunghi, richiedono abilità tecniche o non sono adatti per la coltura 6,7,8,9,10,11,12. Descriviamo un metodo semplice e veloce per isolare le cellule RPE da topi adulti che producono colture altamente pure di queste cellule.

Protocol

L'uso di soggetti animali in questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Case Western Reserve University.

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare il mezzo tampone di lavaggio integrando la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo con 10 mM di soluzione tampone HEPES. Conservare la soluzione a 4 °C fino al momento dell'uso.
2. Preparare il terreno RPE integrando il Medium Eagle's Modified di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio, 1,25x GlutaMAX Supplement (concentrazione madre 100x o 200 mM; concentrazione finale di 2,5 mM di L-glutammina), con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina/streptomicina e 1x MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x). Prima dell'uso, preriscaldare il fluido a 37 °C a bagnomaria.

2. Estrazione dell'occhio del topo

1. Eutanasia del topo, preferibilmente di età compresa tra 3 e 14 settimane, utilizzando un metodo di eutanasia approvato dall'IACUC (la lussazione cervicale in anestesia utilizzando un cocktail di ketamina/xilazina a 0,1 ml per 20 g di topo [87,5 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilazina] è stato il metodo utilizzato in questo studio).
   NOTA: Gli occhi raccolti da topi più giovani faciliteranno l'aumento della resa delle cellule epiteliali pigmentate retiniche nel tempo e estenderanno la capacità di passaggi successivi.
2. Appoggia il mouse su un lato con l'occhio orientato verso l'alto.
3. Posiziona rispettivamente l'indice e il pollice sopra e sotto l'occhio. Applicare delicatamente una pressione sulla struttura ossea che circonda l'occhio per indurre la sporgenza del bulbo oculare.
4. Inserire la punta delle forbici leggermente aperte sotto l'occhio e ruotare delicatamente il polso lontano dall'occhio di 90° fino a quando l'occhio non si stacca dall'orbita.
   NOTA: Non chiudere le forbici per tagliare l'occhio o il nervo ottico, poiché renderebbe più difficile la dissezione dell'oculare.
5. Posizionare e ruotare immediatamente l'occhiello in etanolo al 70% per non più di 5 secondi prima di trasferirlo in un mezzo tampone di lavaggio tenuto in ghiaccio.
6. Al microscopio da dissezione, trasferire un occhio alla volta in una capsula di Petri riempita con tampone di lavaggio e strisce di garza imbevuta.
7. Stabilizzare l'occhio tenendo il nervo ottico con una pinzetta. Praticare delicatamente un'incisione a livello dell'ora serrata utilizzando un coltello chirurgico da 3,00 mm a 45° o una lama di rasoio da 0,009".
8. Usando le forbici Vannas, inserisci delicatamente la forbice nell'incisione e taglia attorno alla circonferenza dell'ora serrata fino a quando il segmento anteriore e il vitreo possono essere rimossi e scartati.
9. Staccare delicatamente la retina dall'oculare utilizzando una pinza legata, facendo attenzione a non disturbare lo strato di RPE.
   NOTA: Per facilitare la rimozione della retina, riempire una pipetta di trasferimento con un mezzo tampone di lavaggio e applicarlo con cura sui bordi dell'oculare per sollevare delicatamente la retina.
10. Infine, rimuovere il nervo ottico e il tessuto connettivo in eccesso dall'oculare usando le forbici. Fare attenzione a non forare l'oculare.

3. Isolamento dell'RPE primario

1. Trasferire l'oculare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di tripsina allo 0,25% + EDTA allo 0,02%.
   NOTA: È possibile aggiungere due conchiglie oculari a un'aliquota di tripsina-EDTA per aumentare la resa di RPE coltivabile.
2. Trasferire le provette per microcentrifuga in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per 10 minuti. Ogni 2 minuti, rimuovere i tubi dal bagnomaria e picchiettare con decisione il fondo del tubo 40 volte sul piano di lavoro.
3. Dopo 10 minuti, interrompere delicatamente l'oculare meccanicamente utilizzando una pipetta sierologica P1000 o da 2 mL pipettando su e giù non più di 3 volte.
   NOTA: La frammentazione dei fogli RPE è essenziale poiché i fogli di grandi dimensioni non aderiranno correttamente.
4. Neutralizzare immediatamente la tripsina sovrapponendo i fogli di RPE staccati, ma non l'oculare, su 0,5 mL di siero fetale bovino (FBS) in una provetta conica da 15 mL.
5. Inoltre, diluire la tripsina sovrapponendo 3 mL di terreno RPE goccia a goccia sugli strati di FBS e fogli RPE.
6. Centrifugare l'RPE a 340 x g per 3 min.
7. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in una quantità adeguata di terreno RPE per una piastra a 24 pozzetti (1,9 cm²/pozzetto) o una piastra a 48 pozzetti (0,75 cm²/pozzetto).
   NOTA: L'RPE può essere placcato su piastre a pozzetti rivestite con proteine della matrice extracellulare, in particolare laminina, collagene IV o fibronectina, per aumentare l'aderenza¹¹. L'RPE può anche essere risospeso in 1 mL di terreno RPE e stratificato su un gradiente di separazione di densità del 40% per isolare ulteriormente le cellule RPE pure. Inoltre, la rotazione della piastra a 340 x g per 3-5 minuti può aumentare l'adesione cellulare¹³.
8. Incubare a 37 °C al 5% di CO₂.

4. Coltura di RPE

1. Non interrompere l'RPE isolato per almeno 3 giorni. Dopo 72 ore, rimuovere delicatamente il vecchio mezzo e sostituirlo con un supporto fresco e preriscaldato.
2. Cambiare il supporto ogni 48 ore dopo i primi 3 giorni.
3. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, far passare le cellule utilizzando lo 0,25% di tripsina + 0,02% di EDTA e ridurre l'FBS nel terreno RPE al 2%.
   NOTA: In precedenza era stato riportato che l'RPE primaria iniziava la de-differenziazione dopo 5-7 passaggi e iniziava a perdere la sua forma esagonale e la pigmentazione¹⁴.

Results

Il protocollo descritto è stato utilizzato su topi di fondo C57BL/6. Il genere non sembra cambiare la capacità di coltivare l'EPR. I topi con meno di 6 settimane producono fogli di RPE limitati rispetto ai topi più anziani e potrebbero essere necessari più occhi per raggiungere la confluenza ottimale. Dopo l'isolamento, le cellule RPE impiegano circa 3 giorni per stabilizzarsi e attaccarsi alla piastra di coltura cellulare. Circa 24 ore dopo l'isolamento, le cellule rotonde e pigmentate che sembrano anucleate hanno iniziato a depositarsi ma non hanno aderito completamente alla piastra (Figura 1A). Nelle successive 48-72 ore, le cellule iniziano ad attaccarsi e diffondersi mantenendo la loro pigmentazione scura e il nucleo trasparente (Figura 1B, C). Dopo 5 giorni, gli RPE hanno aumentato la confluenza e hanno iniziato a formare contatti cellula-cellula che ricordano un monostrato polarizzato con una forma esagonale (Figura 1D).

Gli RPE isolati sono stati valutati per la purezza e l'integrità della giunzione stretta dopo 6 giorni di coltura. Gli RPE sono stati valutati per la prima volta per la presenza di retinoide isomeroidlasi o proteina 65 kDA dell'epitelio pigmentato retinico (RPE65), un marcatore specifico per l'EPR (Figura 2, verde). Inoltre, affinché l'RPE formi un singolo strato di cellule pigmentate e di forma esagonale, le giunzioni cellula-cellula devono rimanere intatte. La proteina a giunzione stretta-1 o zonula occludens-1 (ZO-1) sono proteine di impalcatura vitali per il mantenimento e l'integrità delle giunzioni strette tra le singole cellule RPE¹⁴. Le colture confluenti di RPE isolate hanno mantenuto le loro proteine della giunzione intercellulare, come dimostrato dalla colorazione di ZO-1 trovata alla periferia della cellula (Figura 2, rosso). Una volta che queste cellule raggiungono la confluenza in grandi fogli, mantengono i contatti cellula-cellula senza crescere eccessivamente per un massimo di 2 settimane. Studi precedenti hanno dimostrato che ZO-1 è espresso in modo elevato per un massimo di 9 giorni in coltura¹⁵. Ulteriori marcatori utilizzati nelle colture di RPE primaria includono Collagen IV, CRALBP e OTX2¹¹.

Figura 1. Morfologia dell'RPE primaria di topo coltivata su piastra standard in polistirene a 24 pozzetti. (A) RPE primario isolato da entrambi gli occhi di un topo C57BL/6 e coltivato in un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in polistirene per colture tissutali non rivestite subito dopo l'isolamento. (B,C) Dopo 48 ore e 72 ore, l'RPE primaria inizia ad aderire alla piastra e a formare cellule pigmentate e binucleate. (D) Dopo 5 giorni, la microscopia in campo chiaro mostra che le cellule iperpigmentate di forma esagonale aumentano la confluenza e iniziano a formare contatti cellula-cellula. Barra della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Il marcatore RPE-65 e il marcatore di giunzione intercellulare, ZO-1, sono conservati nell'RPE murino primario isolato. L'RPE primario di tre topi C57BL/6 è stato coltivato per 6 giorni prima della fissazione con paraformaldeide al 4%. Le cellule sono state permeabilizzate con Triton-X allo 0,1% in PBS per 5 minuti, bloccate con siero di capra normale al 5% e incubate con anticorpi contro RPE-65 (verde) o ZO-1 (rosso). Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Rappresentazione schematica semplificata del protocollo di isolamento dell'epitelio pigmentato retinico. Dopo aver rimosso il bulbo oculare dal mouse, sterilizzare l'occhio immergendolo brevemente in etanolo al 70% prima di passare al tampone di lavaggio. Nel tampone di lavaggio, tagliare lungo l'ora serrata e rimuovere il segmento anteriore. Rimuovere la retina e posizionare l'oculare in un tubo con tripsina/EDTA. Picchiettare delicatamente la provetta sul bancone ogni 2 minuti per un totale di 10 minuti, trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 ml e centrifugare il pellet di RPE. Risospendere le cellule e la piastra su una piastra a 24 o 48 pozzetti. Grafica generata utilizzando BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In questo articolo, abbiamo delineato un protocollo semplificato per l'isolamento e la coltura dell'epitelio pigmentato retinico murino. Le cellule RPE isolate dagli occhi di topi adulti esprimevano un marcatore specifico per RPE, RPE65, e un marcatore di giunzione intercellulare, ZO-1. Inoltre, le cellule coltivate si sono sviluppate in fogli esagonali pigmentati in coltura.

Diversi metodi per l'isolamento dell'RPE nei roditori sono stati pubblicati in precedenza 6,7,8,9,10,11,12. Molti protocolli staccano gli strati di RPE dalla membrana di Bruch, richiedendo abilità tecniche e aumentando il rischio di danni da RPE o morte cellulare 6,7,9,11,12,16. Pertanto, questo protocollo utilizza il distacco enzimatico dello strato di RPE, piuttosto che la dissociazione meccanica, per promuovere la sopravvivenza e mantenere l'integrità dei fogli di RPE in coltura. Questo metodo produce RPE di topo in una coltura che mantiene la morfologia dell'RPE con cellule altamente pigmentate e di forma esagonale che conservano l'espressione delle proteine a giunzione stretta. Inoltre, questo protocollo manca dell'uso di reagenti complessi o materiali utilizzati in altri protocolli, come inserti di membrana permeabili, proteine di rivestimento della matrice extracellulare aggiuntive o reagenti specializzati per la dissociazione tissutale. Invece, questo protocollo utilizza una semplice digestione enzimatica utilizzando lo 0,25% di tripsina-EDTA in combinazione con l'agitazione dei tessuti per dissociare lo strato di RPE dalla membrana di Bruch. Questo protocollo è stato eseguito con successo su topi di età compresa tra 3 e 14 settimane; Tuttavia, potrebbero essere necessari più occhi per ottenere con successo una coltura confluente nei topi giovani.

Durante l'esecuzione di questo protocollo possono sorgere diverse sfide. È necessaria un'abilità tecnica per tagliare con precisione intorno all'ora serrata e rimuovere con cura la retina senza interrompere lo strato di RPE. La retina può essere disturbata durante il taglio della circonferenza della sclera, il che può alterare la vitalità dell'RPE. L'affinamento di questa tecnica può essere raggiunto solo attraverso la pratica ripetitiva e continua. Inoltre, i fogli di RPE possono rimanere attaccati allo strato retinico dopo la rimozione. Per evitare un'eccessiva perdita di RPE, stimolare il distacco della retina utilizzando una siringa o una pipetta di trasferimento riempita con un tampone di lavaggio per sollevare delicatamente i bordi della retina dall'oculare. L'incubazione della ialuronidasi può anche facilitare il distacco¹⁶. Nel caso in cui gli EPR non si stacchino correttamente dalla membrana di Bruch e dalla coroide, aumentare il tempo di incubazione con tripsina nel bagno d'acqua. Inoltre, congelare le aliquote di tripsina fresca a -20 °C e scongelarle direttamente prima dell'uso per mantenere un'attività enzimatica ottimale. Se le cellule vengono seminate a una densità troppo bassa o se l'RPE è stato danneggiato durante il processo di isolamento, può verificarsi un mancato attaccamento dell'RPE alla piastra del pozzetto dopo l'isolamento. Inoltre, il nostro protocollo non richiede il rivestimento di proteine della matrice extracellulare (ECM) per la coltura. Tuttavia, è stato dimostrato che le proteine della MEC, come la fibronectina, il collagene IV, la laminina o il collagene I, aumentano l'attaccamento cellulare e dovrebbero essere prese in considerazione se l'aderenza è scarsa¹¹.

Per aumentare la resa di monostrati coltivati con RPE, raggruppare almeno 2-3 occhi di topi di pari età con lo stesso background genetico; Le cellule possono perdere la loro forma esagonale e il pigmento nel tempo se non vengono seminate a una densità sufficientemente alta. Per i topi di età superiore alle 8 settimane, 2 occhi per piastra a 24 pozzetti dovrebbero essere sufficienti per una confluenza ottimale. Se i topi hanno meno di 8 settimane, 3-4 occhi si tradurranno in una migliore aderenza e confluenza. Nel tempo, le cellule possono essere suscettibili alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT) con perdita di pigmentazione e acquisizione di una forma allungata. L'aggiunta di inibitori della Rho-Kinasi e del TGFβR-1/ALK5, come Y27632 e Repsox, rispettivamente, può prevenire l'EMT delle cellule RPE in coltura¹². Sebbene il protocollo di isolamento sia breve, richiedendo solo 1 ora per l'isolamento di 2-4 occhi, la coltura primaria può richiedere fino a 7-10 giorni per raggiungere la piena confluenza. Inoltre, il passaggio dell'RPE è limitato, con un aumento del rischio di EMT ad ogni passaggio successivo.

Le cellule epiteliali pigmentate retiniche sono cellule fondamentali per il mantenimento dell'omeostasi nell'occhio. Gli RPE agiscono come fagociti per favorire il mantenimento dei fotorecettori, prevenire i danni alla luce degli strati neurali e fungere da barriera epiteliale stretta per regolare il trasporto¹⁷. Le malattie che colpiscono direttamente l'EPR, come la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa e la retinopatia diabetica, possono esacerbare l'infiammazione, aumentare l'apoptosi e interrompere le giunzioni cellulari, portando ad un aumento della probabilità di degenerazione retinica e cecità¹⁷. La coltivazione di RPE primarie facilita lo studio della patogenesi delle malattie oculari che colpiscono l'EPR. In conclusione, il nostro protocollo riduce la durata dell'isolamento e semplifica le tecniche e i reagenti necessari, mantenendo al contempo una coltura cellulare di elevata purezza.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,009 RD Lame a taglio singolo	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio
Siero fetale bovino	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Soluzione salina bilanciata di Hank	Gibco	14175095	senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo
Soluzione tampone HEPES (1M)	Gibco	15630106
MEM Aminoacidi non essenziali, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Coltello	BVI Beaver	377546
Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x	Corning	30-002-CI
	Falcon	08-772-1	24 o 48 pozzetti
	Corning	35-010-CV
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	con forbici Vannas rosso fenolo
	Strumenti di scienza	10091-12