Bedöma Neurala Motility Stem Cell Använda en agarosgel-baserade mikroflödessystem enhet
Summary
Vi visar att mer än uttryck för epidermal receptorer tillväxtfaktor (EGFR) förbättrar motiliteten av neurala stamceller (NSCs) med en roman agarosgel baserade mikroflödessystem enhet. Denna teknik kan lätt anpassas till andra däggdjur cellsystem där cell källorna är knappa, såsom mänskliga neurala stamceller, och vända tid är kritisk.
Abstract
Medan mikroflödessystem tekniken är att nå en ny nivå av mognad för makromolekylära analyser, cellbaserade analyser är fortfarande på ett spädbarn etapp 1. Detta beror till stor del på svårigheten med vilken man kan skapa en cell-kompatibel och stadig mikromiljö med konventionell mikrofabrikation tekniker och material. Vi tar upp detta problem genom att införa ett nytt mikrofabrikation material, agarosgel, som bas material för mikroflödessystem enhet. Agarosgel är mycket formbart och släpper igenom gas och näringsämnen som behövs för cellens överlevnad, och därmed ett idealiskt material för cell-baserade analyser. Vi har visat tidigare att agarosgel baserade enheter har varit framgångsrika i att studera bakterier och neutrofiler cell migration 2. I denna rapport finns tre parallella mikroflödessystem kanaler mönstrade i en agarosgel membran av ca 1 mm tjocklek. Konstant flöde med media / buffert bibehålls i två sidan kanalerna med en peristaltiska pumpar. Celler bibehålls i centerkanalen för observation. Eftersom näringsämnen och kemikalier i sidokanalerna ständigt spridande från sida till centerkanalen, den kemiska miljön i centerkanalen enkelt kontrolleras via flödet längs kanalerna. Med hjälp av denna enhet, visar vi att rörelsen av neurala stamceller kan övervakas optiskt med lätthet under olika kemiska förhållanden, och de experimentella resultaten visar att mer än uttryck för epidermal receptorer tillväxtfaktor (EGFR) förbättrar motiliteten av neurala stamceller. Motilitet av neurala stamceller är en viktig biomarkör för att bedöma celler aggressivitet, vilket tumörframkallande faktor 3. Dechiffrera mekanismen bakom NSC motilitet kommer att ge insikt i båda sjukdomarna av neurala utveckling och i hjärncancer stamceller invasion.
Protocol
Discussion
Fig.. 1 visar banor av tre NSC stammar, för föräldrakontroll celler, wtEGFR och ΔEGFR (kontroll). Varje uppsättning banor erhölls från en fem timmar lång film. För föräldrarnas celler, kulminerade cell motilitet när fonden koncentrationen ~ 10ng/ml, för wtEGFR celler, skiftade cell motilitet topp till 100ng/ml eller högre, för ΔEGFR celler, var cellen motilitet oberoende av fonden koncentration som förväntat.
Den wtEGF celler med 100ng/ml var de rörliga cellerna, flyttade de ungefär 1,5 gånger snabbare än för?…
Acknowledgements
Detta arbete stöds av New York State Office of Science, Technology och akademisk forskning (NYSTAR) (i form av ett Center for Advanced Technology bidrag) och genom bidrag från Nanobioteknik Center (NBTC), ett STC-program i den nationella Science Foundation i avtalet Nej ECS-9876771, och den amerikanska hjärntumör Association och New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | FisherScientific | BP1356-500 |
Riferimenti
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
