Proteinler, farklı aktin bağlayıcı modüller aracılığıyla ipliksi aktin (F-aktin) bağlanır. Bu video in vitro testinin rutin olarak, F-aktin bağlayan proteinler ya da belirli etki analiz etmek için kullanılan bir co-sedimantasyon, aktin prosedürü göstermektedir.
Abstract
Hücre içinde aktin hücre iskeleti, hücre ve hücresel süreçlerin hareketi sağlayan aktin filamentler bir ağ ve bu gerilim üretir ve hücresel şeklini korur yardımcı olur. Aktin hücre iskeletinin sert bir yapısı olmasına rağmen, sürekli remodeling dinamik bir yapıdır. Proteinlerin çok sayıda aktin hücre iskeletinin bağlayabilirsiniz. F-aktin belirli bir protein bağlayıcı genellikle hücre biyolojik gözlemler ya da daha fazla aktin hücre iskeletinin yeniden şekillenme nedeniyle dinamik süreçleri anlamak için arzu edilir. Aktin co-sedimantasyon tahlil spesifik proteinlerin veya F-aktin protein etki bağlama rutin analiz etmek için kullanılan in vitro tayininde. Testin temel ilkeleri, F-aktin ile ilgi protein bir inkübasyon (tam uzunlukta veya etki alanı), F-aktin ile birlikte sedimenting protein pelet F-aktin ve analiz Ultrasantrifügasyon adım içerir. Aktin co-sedimantasyon deneyleri aktin bağlayıcı yakınlık ve rekabet deneyleri ölçmek için buna göre dizayn edilebilir.
Protocol
1. Aktin hazırlanması Bu testte kullanılan aktin kaynağı Sitoiskelet A.Ş. Menkul Kıymetler alikotları 10 mg / ml -70 º C derin dondurucuda muhafaza elde kas olmayan insan trombositler (β-aktin) oldu. Testi için, aktin 4 º C'de 10 dakika 20.000 g de santrifüj 5 mM Tris pH: 8, 0.2 mM CaCl 2, 0.2 mM ATP ve 0,5 mM DTT, içeren bir tampon 0.4 mg / ml 'ye seyreltilerek Monomerik aktin süpernatant polimerize olmaya hazırdır. Aktin polimerizasyonu Ayrıca 50 mM KCI, 1…
Discussion
Aktin co-sedimantasyon, F-aktin bağlayıcı specfic proteinleri analiz etmek için basit bir in vitro tahlil. Bu videoda, basit bir aktin co-sedimantasyon yapılabilir nasıl bir örnek göstermektedir. Biz F-aktin hazırlamak için nasıl test edilecek protein ve aktin prosedürü co-sedimantasyon hazırlamak. Aktin co-sedimantasyon deneyleri yaparken puan sayısı dikkate alınmalıdır. Örneğin, kuluçka için tampon parçaları, test edilmesi ve pH, sıcaklık ve tuz konsantrasyonu F-aktin bağlayıcı etkileyebilir protein bağlı o…
Acknowledgements
HaCAT hücreleri aktin film için UCSF Wittman laboratuarında Dr. Praveen Kaya için teşekkür ederiz.
Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
Srivastava, J., Barber, D. Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin. J. Vis. Exp. (13), e690, doi:10.3791/690 (2008).