人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ

Summary

最近まで、人間の脳での発現の研究​​は、RNAやタンパク質の定量化に限られていた。このホワイトペーパーで説明されているクロマチン免疫沈降の技術と、それは死後脳における遺伝子発現のヒストンメチル化と他のエピジェネティックな調節因子をマッピングすることが可能となります。

Abstract

このような統合失調症、双極性疾患や自閉症などの慢性神経精神疾患は、遺伝子発現と他の分子病理学のエピジェネティックな変化を引き起こす可能性がある遺伝的要因と環境要因の組み合わせに起因すると考えられています。伝統的に、しかし、死後脳での発現の研究​​は、mRNAやタンパク質の定量化に限られていた。そのような自己消化時間や組織の健全性のばらつきなどの死後脳研究で遭遇する制限はまたより高次のクロマチン構造のいずれかの研究に影響を与える可能性があります。しかし、DNAを含むゲノムDNAのヌクレオソームの組織：結合コアヒストンは – 主に様々な脳の銀行が提供する代表的なサンプルで保存されるように見えます。そのため、死後脳で定義されたゲノムの遺伝子座でのメチル化パターンとコアヒストンの他の共有結合修飾を研究することが可能です。ここで、我々は凍結（固定なし）人間の脳の標本用に簡略化したネイティブクロマチン免疫沈降（NChIP）プロトコルを提示する。脳ホモジネートのミクロコッカスヌクレアーゼの消化から始まる、NChIPは、3日以内に完了することができる定量PCRが続きます。ここで紹介する方法は、通常と病気のヒトの脳における遺伝子発現のエピジェネティックな機構を解明するために有用なはずです。

Protocol

手順： 第1回日 1。バッファをDouncingと冷凍事後灰白質組織の50から500 mgをホモジナイズする。 ！注意 – ！ヒト組織は、厳格な安全条件の下で慎重に取り扱う必要があります。それは、BSL – 2以上の安全基準で処理する必要があります。 以前に解剖、検死-80〜脳° C、バッファをDouncingの5倍脳容?…

Discussion

プロトコルは、これらのクロマチンのマーキングは^、（ヒストン）アセチル化とリン酸化^1を含む変更の他のタイプと比較して、死後のアーチファクトが発生しにくくなる可能性があるため、人間の脳のヒストンおよび/ ​​またはDNAメチル化の署名に興味がある研究者のために特に有用であるここで概要を説明^2。死後脳では、モノヌクレオソームの調製の研究に適している、DNAは、…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Tris-HCl		EMD	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate		OmniPur	5980
Calcium Chloride		Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0		OmniPur	4055
Sodium Chloride		Mallinckrodt Chemicals	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)		Bio-Rad	161-0416
Triton X-100		Fluka	93426
Igepal CA-630		Sigma	I-3021
Sodium Deoxycholate		Sigma	D6750-25G
Lithium Chloride		Sigma	L9650-100G
Sodium Bicarbonate		Sigma	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)		Sigma	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus		Sigma	N3755-200UN
Benzamidine		Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride		Sigma	P7626-1G
3M DTT		Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow		Upstate	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit		Stratagene	201190
Proteinase K from Engyodontium album		Sigma	P2308
Phenol:Chloroform 1:1		OmniPur	6810
Glycogen, From Mussels		Sigma	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)		Pharmco-AAPER	111000200

Solutions:

• nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ adjust pH to 7.5
• 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
• Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
• High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
• Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
• TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
• Elution Buffer: 0.1M NaHCO₃, 1% SDS
• Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
• 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.