Sökning efter Mitokondriell komplex aktivitet på mänskliga embryonala stamcellslinjer
Summary
I den här videon kommer vi att visa dig hur det mitokondriella andningskedjan komplex av mänskliga embryonala stamceller kan analyseras med hjälp av analyser gel aktivitet.
Abstract
Mitokondrierna är cytoplasmiska organeller som har en central roll i cellulär metabolism och homeostas, reglering av cellsignalering nätverket och programmerad celldöd. Mitokondrier producerar ATP, reglera cytoplasmisk redox staten och Ca2 + balans, katabolisera fettsyror, syntetisera heme, nukleotider, steroidhormoner, aminosyror, och hjälpa montera järn-svavel-kluster i proteiner. Mitokondrierna har också en viktig roll i värmeproduktionen. Mutationer av mitokondriella genomet orsaka flera typer av mänsklig störning. Ansamling av mtDNA mutationer korrelerar med åldrande och misstänks ha en viktig roll i utvecklingen av cancer. På grund av sin mycket viktig roll i alla typer av celler måste mitokondriernas funktion också vara avgörande för stamceller. Viktiga framsteg har gjorts i vår förståelse av stamceller livskraft, tillväxt och differentiering kapacitet. Men den funktionella aktiviteten av stamceller, i synnerhet deras energi status, inte var ännu inte studerats i detalj. Nästan ingenting är känt om mitokondriella egenskaper av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och deras differentierade föregångare avkomma. Ett sätt att förstå och värdera betydelsen av mitokondrier i hESC funktion och utvecklingspotential är att direkt mäta aktiviteten av mitokondriell andningsorganen komplex. Här beskriver vi hög upplösning tydliga infödda gelelektrofores och efterföljande i gel aktivitet visualisering som en metod för att analysera de fem andningskedjan komplex av hESCs.
Protocol
Discussion
I denna video har vi beskrivit utvinning av mitokondriella proteinkomplex från mänskliga embryonala stamceller, deras separation med hög upplösning tydliga infödda gelelektrofores (hrCNE) och den efterföljande analysen av i-gel katalytisk aktivitet analyser. hrCNE löser mitokondriella komplex membranprotein med en upplösning jämförbar med blå infödda gelelektrofores och är överlägsen i-gel aktivitet analyser. Denna teknik kan användas inte bara för att kvantifiera mitokondrie andningsorganen komplex IV, men också att analy…
Acknowledgements
Mänskliga embryonala stamceller studier i Teitell labbet stöds för närvarande av en California Institute för regenerativ medicin (CIRM) frö bevilja RS1-00.313. Vi tackar Dr Carla Koehler (UCLA) och medlemmar av Koehler laboratorium för att ge råd och insikt i dessa och ytterligare studier.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH | |
| 1M NaCl | Sigma | S3014-500MG | ||
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | ||
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C | |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD | 9010 | store at 4 C | |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma | I-2399 | store at 4 C | |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | ||
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. | |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. | |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C | |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. | |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. | |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. | |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | ||
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | ||
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | ||
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | ||
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma | A2383-5G | Grade I, minimum 99% | |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma | N-8129 | ||
| Cytochrome c From horse heart | Sigma | C2506-250MG | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | ||
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Store at – 20 C. | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | ||
| Trypan blue Stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | ||
| 10x Trypsin (0.5%) | Gibco | 15400-054 | ||
| Trypsin Inhibitor | Gibco | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).
