Com o crescente interesse em terapias com células-tronco, técnicas de imagem molecular são ideais para monitorar o comportamento de células-tronco após o transplante. Genes repórter luciferase permitiram não-invasivo de avaliação, repetitiva de sobrevivência da célula, localização e proliferação in vivo. Este vídeo vai demonstrar como controlar a proliferação CTEh em um rato vivo.
A descoberta de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) aumentou drasticamente as ferramentas disponíveis para cientistas médicos interessados em medicina regenerativa. No entanto, a injeção direta de hESCs e células diferenciadas de hESCs, em organismos vivos até agora tem sido dificultada pela morte celular significativa, a formação de teratoma, e rejeição imune do hospedeiro. Compreensão do comportamento em CTEh vivo após o transplante exige técnicas de imagem inovadora para monitorar longitudinalmente localização CTEh, proliferação e viabilidade. A imagem molecular tem dado investigadores um meio de alto rendimento, baixo custo, e sensível para o rastreamento na proliferação celular vivo ao longo de dias, semanas e até meses. Este avanço tem aumentado significativamente a compreensão da cinética espaço-temporal de enxerto CTEh, proliferação e formação de teratoma, nos indivíduos que vivem.
Um grande avanço em imagem molecular tem sido a extensão dos ensaios não-invasivo gene repórter da biologia molecular e celular em plataformas in vivo modalidade multi-imagem. Estes genes repórter, sob controle de promotores e potenciadores de engenharia que se aproveitam da maquinaria transcricional da célula hospedeira s, são introduzidas nas células usando uma variedade de métodos de vetor e vetor não. Uma vez na célula, genes repórter pode ser transcrita ou constitutivamente ou apenas sob determinadas condições biológicas ou celular, dependendo do tipo de promotor usado. Transcrição e tradução de genes repórter em proteínas bioativas é detectada com instrumentação, sensível não-invasiva (por exemplo, câmeras CCD) usando o sinal de geração de sondas, tais como D-luciferina.
Para evitar a necessidade de luz de excitação para rastrear as células-tronco in vivo como é necessário para imagens de fluorescência, bioluminescência repórter sistemas de imagem gene exigem apenas uma sonda exogenamente administrada para induzir a emissão de luz. Firefly luciferase, derivado do Photinus firefly pyralis, codifica uma enzima que catalisa D-luciferina ao opticamente metabólito ativo, oxiluciferina. Atividade óptica pode ser monitorada com uma câmera CCD externa. Estavelmente transduzidas células que carregam o repórter construir dentro de seu DNA cromossômico vai passar o repórter construção de DNA para as células filhas, que permitam um acompanhamento longitudinal de sobrevivência e proliferação CTEh in vivo. Além disso, como expressão do produto do gene repórter é necessário para a geração do sinal, apenas as células viáveis pai e filha vai criar sinal de bioluminescência; células apoptóticas ou morto, não.
Neste vídeo, os materiais e métodos específicos necessários para a proliferação de rastreamento de células-tronco e formação de teratoma com a imagem de bioluminescência será descrito.
Em comparação com outras modalidades, tais como PET e RM, a bioluminescência tem resolução espacial limitada penetração nos tecidos e reduzido devido à energia relativamente fraca de fótons emitidos (2-3 eV); por estas razões que até agora não foi aplicável em animais de grande porte. No entanto, a bioluminescência tem a vantagem de ser de baixo custo, alto rendimento, e não-invasivo, tornando-se altamente desejável para in vivo com células-tronco de rastreamento em pequenos animais. Genes não bioluminescência-repórter, …
Graças a Tim Doyle, PhD e do Centro de Stanford para In Vivo Imaging para assistência com a imagem de bioluminescência. Também graças à Ngan Huang, PhD para compartilhar sua técnica sobre células-tronco co-injeção com uma solução matriz. Por último, graças a Steve Felt, Ph.D. de assistência com cuidados animais veterinária.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | HyClone | |||
BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | StemCell Technologies | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth AG | |||
Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
Baked Pasteur pipets | ||||
6-well tissue culture-treated plates | TPP | 92006 |