Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Summary

Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.

Abstract

Células-tronco hematopoéticas (HSCs) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar todos os tipos de célula das linhagens de sangue durante toda a vida de um indivíduo. Todos os HSCs surgem durante o desenvolvimento embrionário, após o qual o seu tamanho da piscina é mantido por auto-renovação divisões celulares. Identificar a origem anatômica do HSCs e os eventos críticos de desenvolvimento regular do processo de desenvolvimento HSC tem sido complicada como muitos sítios anatômicos participar durante a hematopoiese fetal. Recentemente, foi identificada a placenta como um órgão hematopoiético, onde grandes HSCs são gerados e ampliado em única nichos microambientais (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequentemente, a placenta é uma importante fonte de HSCs durante o seu surgimento e expansão inicial.

Neste artigo, vamos mostrar técnicas de dissecção para o isolamento de placenta murino de E10.5 e E12.5 embriões, o que corresponde aos estágios de desenvolvimento do início do HSCs eo pico do tamanho da piscina HSC na placenta, respectivamente. Além disso, apresentamos um protocolo otimizado para dissociação enzimática e mecânica de tecido placentário em uma única célula de suspensão para uso em citometria de fluxo ou ensaios funcionais. Nós descobrimos que o uso de colagenase por uma única célula suspensão da placenta dá rendimentos suficientes de HSCs. Um fator importante que afeta o rendimento HSC da placenta é o grau de dissociação mecânica antes e duração, o tratamento enzimático.

Nós também fornecemos um protocolo para a preparação de fixo congelado secções de tecido placentário para a visualização do desenvolvimento de HSCs por imuno-histoquímica em seus nichos precisa celular. Como hematopoiéticas antígenos específicos não são preservadas durante a preparação das seções incluídos em parafina, que usam rotineiramente fixo cortes congelados para localizar HSCs placentária e progenitores.

Protocol

1. Remoção do embrião e dissecção da placenta Para começar, os embriões devem primeiro ser isolados de vacas prenhes. Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados – no nosso caso vamos utilizar uma dose letal do anestésico isoflurano Primeiro, spray a barriga com etanol e fazer uma pequena incisão com uma tesoura. Arrancar a pele com ambas as mãos para descobrir o abdômen e corte aberto o peritônio. Com uma pinça, pegue o cornos uter…

Discussion

Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo irá permitir isolamento e visualização do tecido placentário e tronco hematopoiéticas e células progenitoras. Para um resumo abrangente sobre a produção de celulares espera e número de HSCs na placenta e outros órgãos hematopoiéticos fetal durante o desenvolvimento fetal nos referimos a Gekas, et al. 2005. Para localização de HSCs desenvolvimento e outras células hematopoiéticas na placenta nos referimos a Rhodes, et al. 2008.

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)