Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Summary

Hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas durante el desarrollo. Encontramos que las células madre hematopoyéticas (HSC), son generados y ampliado en la placenta en el único nichos microambientales. A continuación, describimos las técnicas experimentales necesarias para el aislamiento y la visualización de la CMH en la placenta del ratón.

Abstract

Las células madre hematopoyéticas (HSC) tienen la capacidad de auto-renovación y generar todos los tipos celulares de los linajes de sangre durante toda la vida de un individuo. Todos los HSCs surgir durante el desarrollo embrionario, después de que su tamaño de la agrupación se mantiene gracias a la auto-renovación de las divisiones celulares. Identificar el origen anatómico de las CMH y los acontecimientos de desarrollo fundamental que regula el proceso de desarrollo de HSC se ha complicado ya que muchos sitios anatómicos participar durante la hematopoyesis fetal. Recientemente, hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas en HSCs se generan y se amplió en exclusiva nichos microambientales (Gekas, et al 2005, Rodas, et al 2008). En consecuencia, la placenta es una fuente importante de HSC durante su surgimiento y la expansión inicial.

En este artículo se muestran las técnicas de disección para el aislamiento de los murinos placenta de E10.5 E12.5 y embriones, correspondientes a las etapas de desarrollo de la iniciación de las CMH y el pico en el tamaño de la piscina HSC en la placenta, respectivamente. Además, presentamos un protocolo optimizado para la disociación enzimática y mecánica de tejido de la placenta en una sola célula de suspensión para su uso en citometría de flujo o ensayos funcionales. Hemos encontrado que el uso de colagenasa por una sola célula de suspensión de la placenta produce rendimientos suficientes de las CMH. Un factor importante que afecta el rendimiento HSC de la placenta es el grado de disociación mecánica antes, y la duración de, tratamiento enzimático.

Disponemos también de un protocolo para la preparación de las secciones fijas congeladas de tejido placentario para la visualización del desarrollo de HSC por inmunohistoquímica en sus nichos celulares precisos. Como hematopoyéticas antígenos específicos no se conservan durante la preparación de las secciones incluidas en parafina, que utilizan habitualmente fija las secciones congeladas para la localización de la placenta y HSCs progenitores.

Protocol

1. La eliminación del embrión y la placenta disección Para empezar, los embriones debe ser aislado de las presas embarazadas. Los animales son sacrificados de acuerdo con los procedimientos aprobados – en nuestro caso vamos a usar una dosis letal del anestésico isoflurano En primer lugar, rocíe el vientre con etanol y hacer una pequeña incisión con un par de tijeras. Arranca la piel con las dos manos para descubrir el abdomen y se abre el peritoneo. Con unas pinza…

Discussion

Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo permitirá que para el aislamiento y la visualización de tejido de la placenta y la madre hematopoyéticas y las células progenitoras. Para un resumen completo sobre el rendimiento esperado y el número de celular de las CMH en la placenta y otros órganos hematopoyéticos fetal durante el desarrollo fetal que se refieren a Gekas, et al. 2005. Para la localización de las CMH en desarrollo y otras células hematopoyéticas de la placenta que se refieren a Rodas, et al. 2008.

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)