光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発
Summary
このビデオでは、水生トラフサンショウウオの網膜スライスにおけるホールセル電圧クランプ記録のプロセスを示しています。網膜の視覚刺激時のパッチクランプ記録を実行する方法を我々は、だけでなく、スライスの準備を示しています。
Abstract
我々は、シナプス回路が網膜の基礎となる視覚情報の処理を研究するためにホールセルパッチクランプ法を使用してください。このビデオでは、我々は、網膜のスライス標本における個々のセルの光誘発電流の全細胞記録を実行するプロセスをガイドします。我々は、動物モデルとして水生トラフサンショウウオを使用してください。我々は目の解剖を記述することで開始し、スライスを電気生理学的記録のためにマウントする方法を示します。スライスが録音室に配置されると、我々は、ホールセル電圧クランプ記録を実行する方法を示します。我々は、その後、光誘発電流応答を引き出すためにスライスに光受容体の上に視覚刺激を投影。録音中に我々は、8チャンネルの灌流システムは、私たちはすぐに別のエージェントを切り替えることができることにより、薬理学的薬剤とスライスを灌流。網膜スライス標本は広く、特にホールマウントの準備にはアクセスできないアマクリンまたは双極細胞を、研究するために、網膜でのパッチクランプ記録のために使用されます。
Protocol
ソリューション神経節細胞の細胞内溶液（mMで）：100 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、1 EGTA、10 HEPES、4 ATP、0.5 GTP、90μMスルホローダミンBの（染色用）、でpH = 7.4に調整KOH 90 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、10 BAPTA、10 HEPES、4 ATP、0.5でpH = 7.4に調整GTP、90μMスルホローダミンB（染色用）、：双極細胞（mMで）のための細胞内液KOH 細胞外リンゲル溶液（mMで）…
Discussion
利点：
- すべての細胞型は、アクセス可能です
- 細胞型の簡単な識別は、特に、蛍光色素は、電極の溶液に添加されている場合
- 薬理学的作用物質は、容易に標的細胞に到達することができます
- パッチクランプ法は、網膜の計算では異なるイオンチャネルの役割を調査することができます。同じ情報が鋭い電極と細胞外スパイクの録音または録画を介して取得することが…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instruments | ||
| Lucivid | Microscope image injector | Mbf bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannfin corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Altro | ITT | ||
| Adhesive silicone wells | Altro | Molecular Probes | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | Milipore | HAWPO1300 | .45µm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan (Nashville, TN) |
Riferimenti
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
Tags
Whole-cell RecordingsLight Evoked Excitatory Synaptic CurrentsRetinal SliceWhole-cell Patch Clamp TechniqueVisual Information ProcessingRetinaAquatic Tiger SalamanderAnimal ModelEye DissectionElectrophysiological RecordingsRecording ChamberWhole-cell Voltage Clamp RecordingsVisual StimuliPhotoreceptorsLight-evoked Current ResponsesPharmacological Agents8-channel Perfusion SystemRetinal Slice PreparationPatch Clamp RecordingsAmacrine CellsBipolar Cells
Citazione di questo articolo
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).