Cellules entières Recordings of Light évoqués courants synaptiques excitateurs dans la tranche la rétine

Summary

Cette vidéo montre le processus de la cellule entière enregistrements pince de tension dans la tranche la rétine de la salamandre aquatique tigre. Nous démontrons la préparation de la tranche ainsi que la façon d'effectuer des enregistrements de patch-clamp pendant la stimulation visuelle de la rétine.

Abstract

Nous utilisons la technique de cellules entières patch clamp pour étudier les circuits synaptiques qui sous-tend le traitement des informations visuelles de la rétine. Dans cette vidéo, nous allons vous guider à travers le processus d'exécution de cellules entières d'enregistrements de la lumière des courants évoqués des cellules individuelles dans la préparation de tranches de la rétine. Nous utilisons la salamandre tigrée aquatiques comme un modèle animal. Nous commençons par décrire la dissection de l'oeil et de montrer comment les tranches sont montés pour des enregistrements électrophysiologiques. Une fois que la tranche est placée dans la chambre d'enregistrement, nous montrent comment effectuer la cellule entière enregistrements voltage. Nous avons ensuite projet de stimuli visuels sur les photorécepteurs de la tranche à susciter la lumière évoque les réponses actuelles. Pendant l'enregistrement, nous perfuser la tranche avec des agents pharmacologiques, par lequel un système de perfusion à 8 canaux nous permet de basculer rapidement entre les différents agents. La préparation de tranches rétiniennes est largement utilisé pour les enregistrements de patch-clamp dans la rétine, en particulier d'étudier ou de cellules amacrines bipolaire, qui ne sont pas accessibles dans une préparation toute monture.

Protocol

Solutions Solution intracellulaire des cellules ganglionnaires (en mm): 100 K-gluconate, 8 KCl, MgCl 1 2, 1 EGTA, HEPES 10, 4 ATP, GTP 0,5, 90 uM Sulforhodamine B (pour la coloration), ajusté à pH = 7,4 avec KOH Solution intracellulaire des cellules bipolaires (en mm): 90 K-gluconate, 8 KCl, MgCl 2 1, 10 BAPTA, HEPES 10, 4 ATP, GTP 0,5, 90 uM Sulforhodamine B (pour la coloration), ajusté à pH = 7,4 avec KOH Ringer extracellulaire de solution (en mM): 112 NaCl, glu…

Discussion

Avantages:

1. Tous les types de cellules sont accessibles
   
2. Identification aisée des différents types cellulaires, en particulier si un colorant fluorescent est ajouté à la solution d'électrode
   
3. Les agents pharmacologiques peuvent facilement atteindre les cellules cibles
   
4. La technique de patch-clamp permet d'étudier le rôle des canaux ioniques différentes dans les calculs de la rétine. La même information ne peut être obtenu grâce à des enregistrements ou des enregis…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Multiclamp 700A	Patch Clamp Amplifier	Molecular Devices
SZX9	Dissection Micropscope	Olympus
BX50WI	Upright Microscope	Olympus		Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
P-97	Micropipette Puller	Sutter Instruments
Lucivid	Microscope image injector	Mbf bioscience
8-channel perfusion system	Microperfusion	Parker Hannfin corporation
Bits++	Digital Video Processor	Cambridge Research Systems
Infrared Oculars	Altro	ITT
Adhesive silicone wells	Altro	Molecular Probes		20mm diameter, 1.0mm deep
Membrane Filters	Filter	Milipore	HAWPO1300	.45µm HA
Borosilicate Glass Capillaries	Electrode glass	World Precision Instruments	1B150-4
Syringe Filters	Filter	Whatman	6789-0402	4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing
IR camera	Micropscope mounted camera	Sony	SPT-M324	Extrawave HAD, B7W video camera
Picrotoxin	Reagent	Sigma	P1675
Strychnine	Reagent	Sigma	S0532
Imidazole-4-acetic acid sodium salt	Reagent	Sigma	I7013
Larval tiger salamanders	Animal	Charles E. Sullivan (Nashville, TN)