De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

Summary

Este vídeo muestra el proceso de células enteras grabaciones pinza de voltaje en la porción de retina de la salamandra tigre acuático. Se demuestra la preparación de la corte, así como la forma de realizar grabaciones de patch clamp durante la estimulación visual de la retina.

Abstract

Utilizamos la técnica de patch clamp de célula entera para estudiar los circuitos sinápticos que subyace en el procesamiento de información visual en la retina. En este vídeo, le guía a través del proceso de desarrollo de células enteras grabaciones de la luz corrientes evocadas de células individuales en la preparación rebanada de la retina. Usamos el medio ambiente acuático salamandra tigre como un modelo animal. Comenzamos con la descripción de la disección de los ojos y mostrar cómo se montan las rebanadas de registros electrofisiológicos. Una vez que el corte se coloca en la cámara de grabación, que muestran cómo realizar grabaciones de células enteras de fijación de voltaje. A continuación, los proyectos de estímulos visuales en los fotorreceptores en el corte de luz para obtener respuestas evocadas actual. Durante la grabación que perfundir en el sector con agentes farmacológicos, por un sistema de perfusión de 8 canales que nos permite cambiar rápidamente entre los diferentes agentes. La preparación rebanada de retina es ampliamente utilizado para las grabaciones de patch clamp en la retina, en particular para estudiar amacrinas o células bipolares, que no son accesibles en una preparación de todo el montaje.

Protocol

Soluciones Solución intracelular de las células ganglionares (en mM): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH Solución intracelular de las células bipolares (en mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH Ringer extracelular de solución (en mM): 112 NaCl, 5 de glucosa,…

Discussion

Beneficios:

1. Todos los tipos de células son accesibles
   
2. Fácil identificación de los tipos de células, en particular si un tinte fluorescente se añade a la solución de electrodos
   
3. Agentes farmacológicos pueden llegar fácilmente a las células diana
   
4. La técnica de patch clamp permite investigar el papel de los diferentes canales iónicos en los cálculos de la retina. La misma información no se puede obtener a través de grabaciones extracelulares pico o grabaciones con electr…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Multiclamp 700A	Patch Clamp Amplifier	Molecular Devices
SZX9	Dissection Micropscope	Olympus
BX50WI	Upright Microscope	Olympus		Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
P-97	Micropipette Puller	Sutter Instruments
Lucivid	Microscope image injector	Mbf bioscience
8-channel perfusion system	Microperfusion	Parker Hannfin corporation
Bits++	Digital Video Processor	Cambridge Research Systems
Infrared Oculars	Altro	ITT
Adhesive silicone wells	Altro	Molecular Probes		20mm diameter, 1.0mm deep
Membrane Filters	Filter	Milipore	HAWPO1300	.45µm HA
Borosilicate Glass Capillaries	Electrode glass	World Precision Instruments	1B150-4
Syringe Filters	Filter	Whatman	6789-0402	4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing
IR camera	Micropscope mounted camera	Sony	SPT-M324	Extrawave HAD, B7W video camera
Picrotoxin	Reagent	Sigma	P1675
Strychnine	Reagent	Sigma	S0532
Imidazole-4-acetic acid sodium salt	Reagent	Sigma	I7013
Larval tiger salamanders	Animal	Charles E. Sullivan (Nashville, TN)