Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция
Summary
Это видео демонстрирует технику микроинъекции в гонаде C. Элеганс для создания трансгенных животных.
Abstract
Трансгенные Caenorhabditis Элеганс может быть легко создан с помощью микроинъекции ДНК плазмиды раствора в гонады 1. ДНК плазмиды перестраивает сформировать внехромосомными concatamers, которые стабильно наследуются, хотя и не с такой же эффективностью, как фактическое хромосомы 2. Интересующего гена совместно вводили очевидным фенотипических маркеров, таких как РОЛ-6 или GFP, чтобы отбор трансгенных животных при вскрытии микроскопом. Экзогенного гена может быть выражена от его родного промоутер для сотовых исследования локализации. Кроме того, трансгенов может быть вызвано различными тканеспецифические промоутер для оценки роли продукта гена в данной клетки или ткани. Этот метод эффективно диски экспрессии генов во всех тканях C. Элеганс, за исключением половых или раннего эмбриона 3. Создание трансгенных животных широко применяется для целого ряда экспериментальных парадигм. Это видео демонстрирует микроинъекции процедуры для создания трансгенных червей. Кроме того, подбор и обеспечение стабильной трансгенных C. Элеганс линии описывается.
Protocol
Discussion
При выполнении этой процедуры, важно помнить, чтобы:
– Вводят непосредственно в центре гонады
– Не вводить слишком много жидкости
– Работать быстро, чтобы предотвратить высыхание.
Если у вас возникли проблемы с иглой, такие, как он сломан слишком большой, то лучше переделать свежей иг…
Acknowledgements
Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Двигательные расстройства исследования в лаборатории была поддержана Бахман-Стросс дистонии и Паркинсона фонд, Соединенные Паркинсона Фонда, американский Паркинсона Болезнь ассоциации, Болезнь Паркинсона Ассоциации Алабама, Майкл Дж. Фокс Фонд исследований болезни Паркинсона, и Undergraduate Research.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
Riferimenti
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetica. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
