マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代
Summary
このビデオでは、トランスジェニック動物を作成するために線虫の生殖巣にマイクロインジェクションのテクニックを示しています。
Abstract
トランスジェニック線虫（Caenorhabditis elegans）は、容易に生殖腺1内へのDNAプラスミド溶液のマイクロインジェクションを使用して作成することができます。プラスミドDNAは安定して実際の染色体の2と同じ効率でも、ではない継承されている体外コンカテマーを形成するために再配置。目的の遺伝子は、解剖顕微鏡下でトランスジェニック動物の選択を可能にするために、そのようなROL – 6やGFPなどの明らかな表現型マーカーと共注入されます。外来遺伝子は、細胞内局在の研究のためにその天然のプロモーターから発現させることができる。また、導入遺伝子は、その特定の細胞または組織における遺伝子産物の役割を評価するために、異なる組織特異的プロモーターによって駆動することができます。この手法は、効率的に生殖細胞または初期胚3以外C. elegansの全組織での遺伝子発現を駆動します。トランスジェニック動物の作成は、広く実験的なパラダイムの範囲に利用されている。このビデオでは、トランスジェニックワームを生成するためにマイクロインジェクションの手順を示しています。さらに、安定したトランスジェニック線虫の行の選択と維持管理が記載されている。
Protocol
Discussion
この手順を行うとき、それは覚えておくことが重要です。
– 生殖腺の中央に直接注入する
– あまりにも多くの液体を注入しない
– dessicationを防ぐために迅速に働く。
もしそれが大きすぎて壊れているような針、で問題に直面している場合、それはむしろ理想的な針よりも小さいと注入しようとするよりも、新鮮な針を再作成するのが最善です。
トランスジェニックワームの発生は、…
Acknowledgements
我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ラボにおける運動障害の研究は、バッハマン-シュトラウスジストニア＆パーキンソン財団、米国パーキンソン財団、米国パーキンソン病協会、アラバマ州のパーキンソン病協会、パーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団、および学部研究によってサポートされています。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
Riferimenti
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetica. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
