产生稳定的转基因C.使用微量注射线虫
Summary
本视频演示，到线虫的性腺创建转基因动物的显微注射技术。
Abstract
转基因线虫可以很容易地创建，通过显微注射DNA质粒的解决方案进入性腺1。质粒DNA的重新排列，形成稳定遗传，但不以同样的效率为 2实际的染色体染色体外concatamers。一个共同感兴趣的基因注入一个明显的表型标记，如ROL – 6或GFP，在解剖显微镜下，允许转基因动物的选择。可能是外源基因表达的细胞定位研究的原始推动者。此外，转基因可以由不同的组织特异性的启动子，以评估在特定的细胞或组织的基因产物的作用。这项技术有效地推动所有组织线虫的生殖细胞或早期胚胎基因表达 3 。转基因动物的创建是广泛使用的实验范式。本视频演示了显微注射过程产生转基因的蠕虫。此外，选择和维护稳定的转基因线虫线描述。
Protocol
表达质粒的构建需要两个质粒：感兴趣的基因组织特异表达的第二个可选择的改造标记之一。 实验质粒选择一个感兴趣的组织/细胞类型，例如，神经或肌肉特异性启动子表达的启动子。如果是同一组织内的多个基因的表达，在网关系统（Invitrogen）的质粒发起人卡带都可以使用。这种方法允许任何利益recombinational克隆4子下游的基因插入，一?…
Discussion
执行此过程时，重要的是要记住：
– 直接注入到性腺中心
– 没有注入过多的液体
– 迅速开展工作，以防止dessication。
如果进针，如它被打破过大的问题，这是最好的改造，而不是试图以比不太理想的针注入新鲜针，。
代转基因蠕虫有许多应用，如：
– 突变基因的鉴定，在方法调用转化救援
– 截短蛋白的表达蛋白结构域的映射，通过
– 一个细胞和疾病的进程的基因的作用表?…
Acknowledgements
我们要感谢考德威尔实验室所有成员的合作精神。运动障碍在实验室的研究已经得到了巴赫曼 – 斯特劳斯肌张力障碍及帕金森基金会，美国帕金森基金会，美国帕金森病协会，阿拉巴马州帕金森氏病协会，迈克尔J.福克斯帕金森病研究基金会，和本科生科研。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
Riferimenti
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetica. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
Citazione di questo articolo
Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).