Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie
Summary
Deze video demonstreert de techniek van micro-injectie in de gonaden van C. elegans om transgene dieren te creëren.
Abstract
Transgene Caenorhabditis elegans gemakkelijk kan worden aangemaakt via micro-injectie van een DNA-plasmide oplossing in de gonaden 1. Het plasmide DNA herschikt te vormen extrachromosomaal concatameren die stabiel zijn geërfd echter niet met dezelfde efficiëntie als de werkelijke chromosomen 2. Een gen van belang is co-geïnjecteerd met een duidelijke fenotypische marker, zoals rol-6 of GFP, om de selectie van transgene dieren mogelijk maken onder een microscoop dissectie. De exogene gen kan worden uitgedrukt van zijn eigen promotor voor cellulaire lokalisatie studies. Als alternatief kan het transgen worden aangedreven door een ander weefsel-specifieke promotor om de rol van het gen product in die bepaalde cel of weefsel te beoordelen. Deze techniek drijft efficiënte genexpressie in alle weefsels van C. elegans, behalve voor de geslachtscellen of vroege embryo 3. Creatie van transgene dieren wordt op grote schaal gebruikt voor een scala aan experimentele paradigma's. Deze video toont de micro-injectie procedure om transgene wormen genereren. Bovendien is selectie en het behoud van stabiele transgene C. elegans lijnen beschreven.
Protocol
Discussion
Bij het doen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden:
– Injecteren direct in het centrum van de gonaden
– Injecteer niet te veel vloeistof
– Snel werken om uitdroging te voorkomen.
Als je in de problemen met de naald, zoals het is gebroken te groot is, is het het beste om remake een verse naald, in plaats van te proberen te injecteren met een minder dan ideale naald.
De generatie van transgene wormen kent vele toepassingen, zoals:
– Identificatie van gemuteerde genen, in de methode g…
Acknowledgements
Wij willen de coöperatieve geest van alle Caldwell Lab-leden erkennen. Bewegingsstoornissen onderzoek in het lab is ondersteund door de Bachmann-Strauss Dystonie & Parkinson Foundation, Verenigde Parkinson Foundation, American Ziekte van Parkinson Vereniging, de ziekte van Parkinson Vereniging van Alabama, de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson, en een Undergraduate Research.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
