הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection
Summary
וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.
Abstract
טראנסגנטי Caenorhabditis elegans ניתן ליצור בקלות דרך microinjection של פתרון ה-DNA פלסמיד לתוך בלוטת המין 1. ה-DNA פלסמיד מארגן מחדש כדי ליצור concatamers extrachromosomal כי הם ירשו ביציבות, למרות שלא כמו כרומוזומים בפועל 2 עם יעילות זהה. הגן של עניין הוא שיתוף מוזרק עם סמן פנוטיפי ברור, כגון רול-6 או ה-GFP, כדי לאפשר בחירה של בעלי חיים מהונדס תחת מיקרוסקופ לנתח. הגן אקסוגני יכול להיות מבוטא מן האמרגן שלו דובר ללימודי לוקליזציה הסלולר. לחלופין, transgene יכול להיות מונע על ידי האמרגן שונה ברקמות ספציפיות על מנת להעריך את התפקיד של המוצר גנים תא רקמה מסוימת. טכניקה זו יעילה כוננים ביטוי הגן בכל רקמות של C. elegans למעט העובר germline או בתחילת 3. יצירת חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב עבור מגוון של פרדיגמות הניסוי. וידאו זה מדגים את הליך microinjection לייצר תולעים מהונדס. יתר על כן, הבחירה ותחזוקה של יציבה מהונדס C. elegans קווי מתואר.
Protocol
Discussion
כשעושים הליך זה, חשוב לזכור:
– להזריק ישירות למרכז אשך
– לא להזריק יותר מדי נוזלים
– עובדים מהר כדי למנוע dessication.
אם אתה נתקל בבעיות עם מחט, כגון זה נשבר גדול מדי, עדיף מהדורה מחודשת מחט טריים, במקום לנסות להזריק עם מחט פחות אידיאלי.
<p style=";text-align…Acknowledgements
אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. הפרעות תנועה מחקר במעבדה כבר נתמך על ידי דיסטוניה בכמן-Strauss & פרקינסון קרן, קרן הברית פרקינסון, מחלת פרקינסון האגודה האמריקאית, מחלת פרקינסון איגוד אלבמה, ג'יי מייקל פוקס, קרן למחקר פרקינסון מחקר לתואר ראשון.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
