Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion
Summary
Denna video visar den teknik för mikroinjektion i gonad av C. elegans för att skapa transgena djur.
Abstract
Transgena Caenorhabditis elegans lätt kan skapas via mikroinjektion av en DNA-plasmid lösningen i gonad 1. Den plasmid-DNA ordnar för att bilda extrakromosomala concatamers som stabilt ärvs, men inte med samma effektivitet som den faktiska kromosomer 2. En gen av intresse är samarbetet injiceras med en uppenbar fenotypisk markör, som rol-6 eller GFP, för att möjliggöra val av transgena djur under en dissekera mikroskop. Den exogena gen kan uttryckas från sin ursprungliga promotor för cellulär lokalisering studier. Alternativt kan transgenen drivas av en annan vävnad-specifika promotorn för att bedöma den roll som genen produkten i just den cell eller vävnad. Denna teknik driver effektivt genuttryck i alla vävnader hos C. elegans förutom könsceller eller tidiga embryot 3. Skapande av transgena djur är allmänt används för en rad experimentella paradigm. Denna video visar mikroinjektion proceduren för att skapa transgena maskar. Dessutom är urvalet och upprätthållande av stabila transgena C. elegans riktlinjer som beskrivs.
Protocol
Discussion
När du gör detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att:
– Injicera direkt i mitten av gonad
– Inte injicerat för mycket vätska
– Arbeta snabbt för att förhindra uttorkning.
Om du stöter på problem med nålen som det bryts för stor, är det bäst att göra om en ny nål, snarare än att försöka att injicera med en mindre än idealisk nål.
Den generation av transgena maskarna har många applikationer såsom:
– Identifiering av muterade gener, i metod som kallas transformation r…
Acknowledgements
Vi vill erkänna den kooperativa andan i alla Caldwell Lab medlemmar. Rörelsestörningar forskning i labbet har fått stöd från Bachmann-Strauss dystoni och Parkinsons Foundation, Förenade Parkinsons Foundation, American Parkinsons sjukdom Association, Parkinsons sjukdom Association of Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson forskning, och en Grundutbildning forskning.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18×18 mm | Fisher | 12-548-A | ||
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22×50 mm | Fisher | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | “Kwik-Fil” | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. . Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
