تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة
Summary
هذا الفيديو يوضح كيفية استخدام جيم ايليجانس لتقييم الدوبامين العصبية تنكس عصبي كنموذج لمرض باركنسون. وعلاوة على ذلك ، تستخدم شاشات الجينية لتحديد العوامل التي تعزز إما انحطاط أو اعصاب.
Abstract
تحسينات في تشخيص وعلاج مرض الشلل الرعاش (PD) تتوقف على معرفة العوامل التي تجعل قابلية السكان المعرضين للخطر. في عملية محاولة تحديد العوامل الوراثية المرتبطة PD الرواية ، وقد ولدت كثير من علماء الجينات قوائم المرشحين ، تعدد الأشكال ، والبروتينات التي تمثل تقدما هاما ، ولكن هذه لا تزال غير معروف يؤدي ميكانيكيا. ويهدف عملنا في اتجاه تضييق هذه القوائم بشكل كبير من خلال استغلال مزايا نظام الحيوان نموذج بسيط. في حين أن البشر لديهم المليارات من الخلايا العصبية ، والمجهرية الدودة ايليجانس انواع معينة و302 على وجه التحديد ، والتي تنتج سوى ثمانية الدوبامين (DA) في hemaphrodites. التعبير عن الجينات البشرية ترميز البروتين PD – المرتبطة بها ، synuclein ألفا ، في نتائج ايليجانس جيم الخلايا العصبية DA في الجرعات والتي تعتمد على سن تنكس عصبي.
معربا عن الديدان البشرية ألفا synuclein في الخلايا العصبية هي DA إسوي والتعبير وحقوق الإنسان على حد سواء GFP ألفا synuclein تحت المروج نقل DA (Pdat – 1). وجود GFP بمثابة علامة تصور بسهولة ليلي DA تنكس عصبي في هذه الحيوانات. أثبتنا في البداية أنه يمكن انقاذ ألفا synuclein التي يسببها DA تنكس عصبي في هذه الحيوانات التي torsinA ، وهو بروتين مع النشاط كوصي الجزيئية 1. مزيد من مرشح PD – الجينات ذات الصلة التي تم تحديدها في المختبر على نطاق واسع عبر جهود الفحص رني باستخدام مقايسة misfolding ألفا synuclein ثم تم الإفراط في المعبر عنها في DA جيم ايليجانس الخلايا العصبية. توصلنا إلى أن خمسة من بين سبعة اختبار الجينات ممثلة جهري مرشح كبير من المشتريات لأنها أنقذت ألفا synuclein التي يسببها DA تنكس عصبي 2. بالإضافة إلى ذلك ، أجرى مختبر ليندكويست (هذه مسألة إن الرب) شاشات الخميرة حيث يستخدم ألفا synuclein تعتمد سمية بوصفها قراءات للجينات التي يمكن أن تعزز أو قمع السمسة. درسنا في وقت لاحق من الجينات المرشحة لدينا الخميرة في مقايسة ايليجانس جيم تنكس عصبي ألفا synuclein المحرض والتحقق من صحة بنجاح العديد من هذه الأهداف 3 و 4.
منهجيتنا ينطوي على جيل من متجه جيم ايليجانس DA التعبير الخلايا العصبية الخاصة به استنساخ الجين cDNAs تهجيني من مرشح تحت سيطرة المروج Pdat – 1. ثم يتم microinjected هذه الديدان في البلازميدات (N2) من النوع البري ، جنبا إلى جنب مع علامة اختيار للتحول الناجح. ويتم الحصول على خطوط متعددة مستقرة وراثيا تنتج البروتين في الخلايا العصبية DA مرشح وعبروا بشكل مستقل ثم إلى سلالة ألفا synuclein التنكسية والمقررة لتنكس عصبي ، في الحيوان على حد سواء وعلى مستوى الخلايا العصبية الفردية ، على مدى الشيخوخة.
Protocol
Discussion
ضياع العمر التي تعتمد على الخلايا العصبية الدوبامين هي السمة المميزة السريري للمرض باركنسون وارتبط مع تراكم أو misfolding من بروتين يسمى ألفا synuclein. نحن هنا لشرح كيفية التسمية ، عن طريق التحوير الفلورسنت ، والخلايا العصبية الدوبامين من C. ايليجانس وتقليد تنكس عصبي ينظر في مرض با…
Acknowledgements
نود أن نعترف الروح التعاونية لجميع أفراد مختبر كالدويل. وقد تم دعم حركة البحث اضطرابات في المختبر من خلل التوتر باخمان شتراوس ومؤسسة باركنسون ، مؤسسة باركنسون المتحدة الأمريكية جمعية مرض باركنسون ، جمعية مرض باركنسون ولاية ألاباما ، وجيه مايكل فوكس مؤسسة للأبحاث مرض باركنسون ، والبحوث الجامعية
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |
Riferimenti
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
