潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション
Summary
このビデオでは、パーキンソン病のモデルとしてドーパミン作動性ニューロンの神経変性を評価するために線虫を使用する方法を示します。さらに、遺伝子スクリーニングは、どちら変性を高めたり、神経保護の要因を識別するために使用されます。
Abstract
パーキンソン病（PD）の診断と治療の改善が危険にさらされる人口をレンダリング感受性要因に関する知識に依存しています。 PDに関連する新たな遺伝的要因を識別しようとする過程で、科学者は候補遺伝子、多型、および重要な進歩を表すタンパク質の多くのリストを生成しているが、これらのリード線は、機構的に未定義のまま。私たちの仕事は大幅に単純な動物モデルシステムの利点を活用することによってこのようなリストを狭めることに狙いを定めています。人間は神経細胞の十億を有しているが、顕微鏡回虫線虫Caenorhabditis elegansは、正確に302 hemaphroditesでのわずか8農産物のドーパミン（DA）があります。投与量と年齢に依存する神経変性におけるC. elegansのDAニューロンの結果でPD -関連タンパク質、α-シヌクレインをコードするヒト遺伝子の発現。
DAニューロンのヒトα-シヌクレインを発現しているワームは同質であり、DAトランスポーターのプロモーター下にGFPとα-シヌクレインのヒト（Pdat – 1）の両方を表現する。 GFPの存在は、これらの動物ではDA神経変性を以下のための容易に視覚化マーカーとして機能します。我々は最初にα-シヌクレイン誘発性のDA神経変性がtorsinA、分子シャペロン活性が1の蛋白質によってこれらの動物で救助できることを実証した。さらに、候補PD関連遺伝子は、C. elegansのDAニューロンで過剰発現されたα-シヌクレインのミスフォールディングのアッセイを用いて大規模なRNAiスクリーニングの取り組みを経由して私たちの研究室で同定した。我々は、彼らがα-シヌクレイン誘発性のDA神経変性2を救出したとして7遺伝子の5人がPDの表現の重要な候補モジュレーターをテストしたことが判明。また、リンドクイストラボ（Joveのこの問題は）酵母の画面を実行したことにより、α-シヌクレイン依存毒性は細胞毒性を増強または抑制することができる遺伝子の読み出しとして使用されます。私たちは、その後、私たちの線虫α-シヌクレイン誘発神経変性のアッセイで酵母の候補遺伝子を調べ、正常にこれらの目標3、4の多くの検証。
私たちの方法論はPdat – 1プロモーターの制御下に候補遺伝子のcDNAの組換えクローニングを使用して、C. elegansのDAニューロン特異的発現ベクターの生成を伴います。これらのプラスミドは、成功した変換のための選択マーカーと共に、野生型（N2）ワームにマイクロインジェクションされています。 DAニューロンの候補タンパク質を生産する複数の安定したトランスジェニック系統が得られ、その後独立してα-シヌクレインの変性株に交差させ、老化の過程で、動物と個々のニューロンレベルの両方で、神経変性について評価されています。
Protocol
Discussion
ドーパミンニューロンの年齢に依存する損失は、パーキンソン病の臨床的特徴であり、α-シヌクレインと呼ばれる蛋白質の蓄積や折り畳みに関連付けられている。ここでは、Cのドーパミン作動性ニューロン、蛍光遺伝子を経由して、ラベルの作成 方法を示しています虫とこれらの細胞で共発現ヒトα-シヌクレインによるパーキンソン病に見られる神経変性を模倣する。
このビデオで…
Acknowledgements
我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ラボにおける運動障害の研究は、バッハマン-シュトラウスジストニア＆パーキンソン財団、米国パーキンソン財団、米国パーキンソン病協会、アラバマ州のパーキンソン病協会、パーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団、および学部研究によってサポートされています
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |
Riferimenti
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
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- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
