Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

Summary

Este vídeo demonstra como usar C. elegans para avaliar neurônio dopaminérgico neurodegeneração como um modelo para a doença de Parkinson. Além disso, as telas genéticos são usados ​​para identificar os fatores que quer aumentar a degeneração ou neuroprotetor.

Abstract

Melhorias para o diagnóstico e tratamento da doença de Parkinson (DP) são dependentes de conhecimentos sobre os fatores que tornam a susceptibilidade populações em risco. No processo de tentar identificar novos fatores genéticos associados com a DP, os cientistas têm gerado muitas listas de genes candidatos, polimorfismos, e proteínas, que representam avanços importantes, mas estas ligações permanecem mecanicamente indefinido. Nosso trabalho estará voltado para a redução significativa tais listas, explorando as vantagens de um sistema simples de animais modelo. Enquanto os seres humanos têm bilhões de neurônios, a lombriga microscópica Caenorhabditis elegans tem precisamente 302, dos quais apenas oito produzir dopamina (DA) em hemaphrodites. Expressão de um gene humano que codifica a proteína PD-associados, alfa-sinucleína, em C. elegans resultados DA neurônios na dose e idade-dependente neurodegeneração.

Worms expressar humana alfa-sinucleína em neurônios DA são isogênicos e expressar tanto GFP e humano alfa-sinucleína sob o promotor transportador DA (PDAt-1). A presença de GFP serve como um marcador facilmente visualizado por seguir neurodegeneração DA nesses animais. Inicialmente demonstrou que alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA poderia ser resgatado nestes animais por torsinA, uma proteína com atividade chaperone molecular ^1. Além disso, o candidato relacionados com a DP genes identificados em nosso laboratório através de esforços em larga escala de triagem RNAi usando um ensaio misfolding alfa-sinucleína foram, então, sobre-expressa em C. elegans DA neurônios. Determinou-se que cinco dos sete genes testados representada moduladores candidato significativa de PD como eles resgatados alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA ^2. Além disso, o Lab Lindquist (esta questão de Jove) realizou telas de fermento em que a alfa-sinucleína dependentes de toxicidade é usado como uma leitura de genes que podem aumentar ou suprimir citotoxicidade. Nós posteriormente examinou os genes candidatos fermento em nossa C. elegans ensaio neurodegeneração alfa-sinucleína induzida e validado com sucesso muitos destes ^{três metas, 4.}

Nossa metodologia envolve a geração de um elegans DA C. vetor de expressão neurônio-específicos usando a clonagem de cDNAs recombinational gene candidato sob o controle do PDAt-1 promotor. Estes plasmídeos são então microinjeção no tipo selvagem (N2) worms, juntamente com um marcador selecionável para transformação de sucesso. Múltiplas estáveis ​​linhagens transgênicas de produzir a proteína nos neurônios DA candidato são obtidas de forma independente e depois cruzou para a cepa alfa-sinucleína degenerativas e avaliados quanto à neurodegeneração, tanto o animal eo nível de neurônio individual, ao longo do envelhecimento.

Protocol

A. Construção Expressão Plasmid Dois plasmídeos são necessários: um para expressão tecido específico do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionável (embora o marcador plasmídeo é geralmente disponível a partir de dentro da comunidade de pesquisa). Experimental Plasmid Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, neste caso, o transportador de DA (PDAt-1) promotor é usado. Es…

Discussion

A perda idade-dependentes de neurônios de dopamina é um marco clínico da doença de Parkinson e tem sido associada com a acumulação ou misfolding de uma proteína chamada alfa-sinucleína. Aqui demonstramos como rótulo, através de um transgene fluorescente, a neurônios dopaminérgicos da C. elegans e imitar a neurodegeneração visto na doença de Parkinson por coexpressing humana alfa-sinucleína nestas células.

Este vídeo mostra a metodologia para a travessia de crescimento, genética, montagem e pontuação de …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Coverglass 20×30 mm		Fisher	12-548-5A
Microscope Slides	Plain, 3×1″	Fisher	12-549
Dissecting with Fluorescence	Microscope	Nikon	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon	SMZ645
Epifluorescent	Microscope	Nikon	Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology