Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener
Summary
Denna video visar hur du använder C. elegans för att bedöma dopaminerga neuron neurodegeneration som modell för Parkinsons sjukdom. Dessutom är genetiska skärmar används för att identifiera faktorer som antingen ökar degeneration eller är nervskyddande.
Abstract
Förbättringar av diagnos och behandling av Parkinsons sjukdom (PS) är beroende av kunskap om känslighet faktorer som gör befolkningar i riskzonen. I processen att försöka identifiera nya genetiska faktorer som är förknippade med PD har forskarna genererat många listor över gener, polymorfismer, och proteiner som representerar viktiga framsteg, men dessa leder fortfarande mekaniskt odefinierade. Vårt arbete riktar mot betydligt förträngning sådana listor genom att utnyttja fördelarna med en enkel djurmodell system. Medan människor har miljarder nervceller har mikroskopiska rundmasken Caenorhabditis elegans exakt 302, varav endast åtta producerar dopamin (DA) i hemaphrodites. Redovisning av en mänsklig gen som kodar för PD-associerad protein, alfa-synuklein, i C. elegans DA nervceller resultat i dosering och åldersberoende neurodegeneration.
Worms uttrycka mänskliga alfa-synuklein i DA nervceller isogena och uttrycka både GFP och mänskligt alfa-synuklein under DA transportör promotor (Pdat-1). Förekomsten av GFP fungerar som en lätt visualiseras markör för följande DA neurodegeneration i dessa djur. Vi visade från början att alfa-synuklein-inducerad DA neurodegeneration kunde räddas med dessa djur genom att torsinA, ett protein med molekylär förkläde aktivitet 1. Vidare kandidat PD-relaterade gener identifierats i vårt labb via storskaliga RNAi screening insatser med hjälp av en alfa-synuklein misfolding analys då var överrepresenterade i C. elegans DA nervceller. Vi bestämde att fem av sju gener testas representerade betydande kandidat modulatorer av PD som de räddade alfa-synuklein-inducerad DA neurodegeneration 2. Dessutom har Lindquist Lab (denna fråga av Jove) utförs jäst skärmar där alfa-synuklein-beroende toxicitet används som en avläsning av gener som kan förstärka eller undertrycka cytotoxicitet. Vi undersökte därefter gener jästen kandidat i vår C. elegans alfa-synuklein-inducerad neurodegeneration analys och framgångsrikt valideras många av dessa mål 3, 4.
Vår metodik innebär generering av en C. elegans DA neuron-specifikt uttryck vektor med Rekombination kloning av cDNAs kandidat genen under kontroll av Pdat-1 promotor. Dessa plasmider är sedan idag injiceras i vildtyp (N2) maskar, tillsammans med en markör för en framgångsrik omvandling. Flera stabila transgena linjerna fram den kandidat proteinet i DA nervceller framställs och därefter självständigt gick in i alfa-synuklein degenerativa stam och utvärderas för neurodegeneration, både på djur och enskilda neuron nivå under loppet av åldrande.
Protocol
Discussion
Den åldersberoende förlusten av dopamin neuroner är en klinisk kännetecknande för Parkinsons sjukdom och har i samband med ackumulering eller misfolding av ett protein som kallas alfa-synuklein. Här visar vi hur du etikett, via en fluorescerande transgen dopaminerga nervceller av C. elegans och efterliknar neurodegeneration ses vid Parkinsons sjukdom genom coexpressing mänskligt alfa-synuklein i dessa celler.
Denna video visar metoden för tillväxt, genetisk korsning, montering och poängsättning av transgena nemat…
Acknowledgements
Vi vill erkänna den kooperativa andan i alla Caldwell Lab medlemmar. Rörelsestörningar forskning i labbet har fått stöd från Bachmann-Strauss dystoni och Parkinsons Foundation, Förenade Parkinsons Foundation, American Parkinsons sjukdom Association, Parkinsons sjukdom Association of Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson forskning, och en Grundutbildning Forskning
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |
Riferimenti
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
