Paradigma's voor farmacologische karakterisering van C. elegans synaptische transmissie Mutants

Summary

Deze video laat zien hoe twee neurale stimulerende middelen, aldicarb en pentyleentetrazol (PTZ), tewerkstellen in complementaire manieren om de synaptische functie in de nematode C. elegans te bestuderen. Deze complementaire aanpak kan ook gebruikt worden om licht te werpen op evolutionair geconserveerd mechanismen voor het moduleren van neuronale synchroon en heeft gevolgen voor epilepsie en aanvallen.

Abstract

Het aaltje, Caenorhabditis elegans, is uitgegroeid tot een zinvol model voor het bestuderen van neurotransmissie. C. elegans is uniek onder de diermodellen, zoals de anatomie en de connectiviteit van het zenuwstelsel is vastgesteld op basis van electronenmicroscoop en verfijnd door de farmacologische assays. In deze video, beschrijven we hoe twee complementaire neurale stimulerende middelen, een acetylcholinesterase-remmer, genaamd aldicarb, en een gamma-aminoboterzuur (GABA)-receptor antagonist, genaamd pentyleentetrazol (PTZ), kunnen worden gebruikt om van een specifiek signalering bij C. elegans neuromusculaire verbindingen (NMJs) en vergemakkelijkt ons begrip van antagonistische neurale circuits.

Van 302 C. elegans neuronen, negentien GABAergische D-type motor neuronen innerveren lichaamswand spieren (BWMs), terwijl vier GABAergische neuronen, genaamd RME's, innerveren hoofd spieren. Omgekeerd, negenendertig motorische neuronen geven de excitatoire neurotransmitter, acetylcholine (ACh), en antagoneren GABA transmissie bij BWMs te voortbeweging te coördineren. De antagonistische karakter van de GABA-erge en cholinerge motorische neuronen in het lichaam muur NMJs werd in eerste instantie bepaald door de laser ablatie en later gesteund door aldicarb blootstelling. Acute blootstelling aan aldicarb resulteert in een time-cursus of de dosis-responsieve verlamming in wild-type wormen. Toch is het verlies van excitatoire transmissie ACh resistentie tegen aldicarb, als minder ACh hoopt zich op worm NMJs, wat leidt tot minder stimulatie van BWMs. Weerstand tegen aldicarb kan worden waargenomen met ACh-specifieke of algemene synaptische functie mutanten. In overeenstemming met antagonistische GABA en ACh overdracht, verlies van GABA transmissie, of een niet negatief te reguleren ACh release, verleent overgevoeligheid voor aldicarb. Hoewel aldicarb blootstelling heeft geleid tot de isolatie van een groot aantal worm homologen van neurotransmissie genen, aldicarb blootstelling alleen kan niet efficiënt bepalen heersende rol voor genen en routes in specifieke C. elegans motorische neuronen. Voor dit doel hebben we een complementaire experimentele benadering, die gebruik maakt van PTZ.

Neurotransmissie mutanten scherm leeg fenotypes, onderscheiden van aldicarb-geïnduceerde verlammingen, in antwoord op PTZ. Wild-type wormen, evenals mutanten met specifieke onvermogen vrij te geven of te ontvangen ACh, blijkt niet duidelijk gevoeligheid voor PTZ. Echter, GABA mutanten, alsook van de algemene synaptische functie mutanten, weer te geven anterior convulsies bij een time-cursus of de dosis-responsieve manier. Mutanten die niet negatief kan reguleren algemene neurotransmitters, en dus scheiden grote hoeveelheden van ACh op BWMs, raken verlamd op PTZ. De PTZ-geïnduceerde fenotypen van discrete mutant klassen aan te geven dat een complementaire aanpak met aldicarb en PTZ blootstelling paradigma's in C. elegans kunnen ons begrip van neurotransmissie te versnellen. Bovendien moet video's te laten zien hoe we farmacologische testen uit te voeren vast te stellen consistente methoden voor het C. elegans onderzoek.

Protocol

Aldicarb Exposure Paradigm Op de eerste dag, ervoor zorgen dat ten minste dertig jonge volwassen stadium wormen van elk genotype en van elke repliceren zullen beschikbaar zijn voor aldicarb assays op de tweede dag. Het is het beste als een experimentator selecteert vijftig of meer L4 stadium wormen op verse NGM platen (best zonder nystatine), die E. bevatten coli (bij voorkeur OP50) als een bron van voedsel, en groeien ze voor 12-24 uur in een consistent en permissieve temperatuur (20 ° C t…

Discussion

De huidige protocollen voor aldicarb blootstelling aan C. elegans staan ​​niet toe dat onderzoekers onderscheid te maken tussen mutanten met specifieke tekorten in ACh transmissie en mutanten met algemene tekorten in synaptische transmissie, aangezien beide klassen van mutanten vertonen weerstand tegen aldicarb. Zo kan aldicarb niet worden gebruikt om te bepalen of mutanten specifieke tekorten in de GABA-transmissie of algemene fouten negatief reguleren ACh transmissie, aangezien beide klassen van mutanten vertonen overgevoelig…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Aldicarb	Reagent	Supelco, Inc.	PS734	Purchasable from Sigma
Pentylenetetrazole	Reagent	Sigma	P6500